s******y
发帖数: 28562 | 1 有一个可能就是你那个全长的蛋白因为一些构象原因不能被pulldown,
反而是被切过的（或者alternatively splice) 的可以被pulldown.
如果你开始用的是native buffer pulldown 的话，不妨换成denaturing pulldown
condition
比方说用 2 %SDS 把细胞给煮了，然后加缓冲液稀释到0.2% SDS再pulldown,
这样一方面可以解决大部分构象原因，另外一方面也会减少背景
当然，如果你比较倒霉的话，这样也有可能导致你什么都pulldown 不下来。这个你得
试一试，就没有人敢给你保证了。 |
|
|
p*********g
发帖数: 9527 | 3 maybe you accidentally mutated a protein splicing recognition cite, so now
you are detecting the precursor instead of the mature one? |
|
b*****l
发帖数: 9499 | 4 先看是不是在 RNA level 的变化：PCR 钓出相关的 mRNA 再转 cDNA 测序看一下 mRNA
的长度和构成有没有变化，isoforms 都有哪些，是不是 splicing/modification 有
不同。有条件的话，RNA-seq 一下。
另外，有没有试试在 E. coli. 里面和原来的 gene side-by-side 地表达一下？ |
|
b*****l
发帖数: 9499 | 5 我是在猜，会不会因为这个突变导致了 post-transcriptional modification 的不同
，比如说某个片段在 w.t. 的 mRNA 中被 splice 掉了，而在 mut 里则没有。估计 lz
说的 sequence 没问题是指 PCR 了一下 mut 点附近的位置的 mRNA？
另外一个可能性就是 post-translational modification。所以建议在 E.Coli. 里重
复一下 mut vs w.t. 看一看。
当然了，最直接的方法是用 MS 做个 protein sequencing -- 这个俺就更不熟了。 |
|
j****x
发帖数: 1704 | 6 估计你做的这个gene甚至物种是没有已知的基因组序列信息的吧，否则你也就不会费劲
做RACE了。
把你的编码产物比对一下近缘物种的基因组序列（如果有全长cDNA序列当然最好），蛋
白质的N端往往是比较保守的，根据近缘物种的ortholog可以很大程度上帮助你确定5'
端起始位点。
如果你确定你拿到了完整的5'端序列（包含UTR），那么根据Kozak规则，ORF里第一个
符合Kozak规则的ATG就很大可能是起始ATG。真核mRNA不同于原核mRNA，基本不存在什
么RBS序列的概念，5' mG cap就是核糖体识别和结合的位点，然后往下游移动遇到合适
的ATG就开始翻译了（至少我当年上医学分子生物学的时候老师是什么说的，呵呵）
如果你不确定你是否获得了完整的mRNA 5'序列，那么继续吧，至少先通过NB等方法确
定一下可能有几个转录本，最长的转录本有多大。因为alternative splicing等等因素
的存在，一个基因存在多个翻译起始位点确实很常见，这也是基因表达调控的一种重要
方式了，遇到这种情况，你可能需要在5' RACE的引物设计上下点心思，用来区别不同
的mRNA产物。 |
|
m***o
发帖数: 272 | 7 谢谢楼上各位。
tozifeng85: 蛋白纯化不出来是不可以打质谱吧，有3个离的很近的ATG都在读码框架里。
juzbox，我做的这个gene有全gene序列，而且已经知道全长cDNA的序列，就是根据全长
序列，我才能说这个短的有3个ATG都在读码框架里。知道基因组序列信息可以怎么做而
不用做RACE呢？有什么网站或者软件推荐吗？
另外蛋白N端比较保守，我觉得不对呢，我读了些alternative splicing 的文章，大部
分是N端不一样，而都保留相同的C端。
我现在比较确定拿到了比较靠5‘端的序列，但是不能保证就是最长的，而且再上游没
有ATG。 现在打算是先设计几个引物，在得到的最长的序列的5’和3‘端，做RTPCR，
然后看看产物强弱，再设计几个RACEprimer比较靠近5’端，再挑一轮clone测序。
另外先转录下游exon再转录上游exon的情况没有人遇到过吗？ |
|
m***o
发帖数: 272 | 8 Philipli,十分感谢你的建议。
做short form 的目的是：wild type 和short form是在不同的组织中表达。以前认为
这个gene only expressed in one specific tissue A, but after the lab got the
knock out mice, it has different phenotype. We trying to figure out the
mechanism if these related with the specific tissue A or the gene also
expressed in other tissue but at short form.
我现在是打算把这个short form最长的ORF表达出来看看，但是老板感兴趣的那个组织
我没有检测到，所以还会继续race.
还有问题没有彻底明白：
1 现在这个short form的TSS,我测到的是大概90bp的差别，是不是可以说是一个TSS
cluster?
2 你说每个cluster里面有大概200bp的差别，记得看过... 阅读全帖 |
|
o**i
发帖数: 1165 | 9 最简单的解释是
有gene的alternative的splice form 里面没有exon4 功能照常
或者你们的exon4的那个construct设计错了 |
|
h********n
发帖数: 4079 | 10 exon 4 deletion应该没错, 两个实验室验证了.
alternatice splice, 怎么验证? |
|
s******r
发帖数: 2876 | 11 不如先RT，western看看还有没有转录和表达。
exon 4 deletion应该没错, 两个实验室验证了.
alternatice splice, 怎么验证? |
|
h********n
发帖数: 4079 | 12 怎么确认可能的alternative splicing? RT-PCR以后测序吗? |
|
i*****g
发帖数: 11893 | 13 我第一反应也是alternative splicing and exon6 required
RT-sequencing.
问题是，如果这种isoform只是发育某个阶段表达，说不定简单RT 找不到
还有个解释是，exon5 对应的domain是毒性的，平时是masked,,, 下面不用我多说了 |
|
n**8
发帖数: 221 | 14 多谢回复！
to院长，
想弄下来测序，看看怎么splicing的，还有看看predicted的motif还在不在，你之前说
的那个分段测序，我已经做过了，可是这并不能说明这个全长的cDNA存在啊？准备做
northern，但是也只能看size，具体的molecular lesion 还是不确定。
你说的这么长PCR出来不reliable，只是先粗测序看看，真正要最终高保真的克隆，当
然会分段做。
to Zifeng9527，
想搞全长的cDNA，自然尽量不会去用random primer 反转。 |
|
|
|
n******7
发帖数: 12463 | 17 大致搜了一下，似乎没有什么general的研究，都是focus到具体某个蛋白
不知道PBD里面一个gene多个isoform都有结构的多不多
麻烦指点一二 |
|
|
n******7
发帖数: 12463 | 19 domain分析我做过一点，但是考虑到residue之间的long range interaction，我很好
奇AS会在多大程度上影响结构。我觉得即使没有general研究这个的文献，对某个重要
蛋白的应该还是有的。大致看了看，似乎有讨论p53 isoform的，还需要再看看。 |
|
w******y
发帖数: 8040 | 20 check Dr. Ying Xu's pubs
PNAS, around 2007 |
|
|
|
S******9
发帖数: 2837 | 23 exon GU------A------AG exon
考step1学的结构。产生的蛋白功能改变，但是免疫活性不变。 |
|
|
m***o
发帖数: 272 | 25 rt.而且这个form只在testes里表达。哎，感觉百忙活了几个月。 |
|
|
s******s
发帖数: 13035 | 27 这个难道不是你自己应该知道或者问老板吗？别人怎么会知道 |
|
P****o
发帖数: 172 | 28 If I were you, I will dig a little bit more. First, you can check EST
database whether there are identical sequences. Second, you can compare full
and variant protein by overexpression in terms of trafficking, degradation,
etc. If nothing happened, you are still able to publish your observation,
also submit the new sequence to genebank. |
|
w******y
发帖数: 8040 | 29 of course you should have a try
design some assays to check the AS variant's stability |
|
b******2
发帖数: 6 | 30 U can contact me if possible. I have some experiments about this type
isoforms thing in testis and actually, I am quite interested in this issue
though I've changed my direction.
L****[email protected] |
|
|
w******y
发帖数: 8040 | 32 NMD的可能性蛮大的
楼主如果啥也不试就放弃就可惜了 |
|
|
g**********t
发帖数: 475 | 34 谁说没蛋白产物就没有意义阿。有一个假说是AS相关的NMD是一种重要的调节基因表达
的机制。比如你的基因在testes里“需要”降低表达量，于是进化出一种isoform，而
这种isoform由于含有PTC会被NMD降解。这样功能产物的表达量就降低了，而且非功能
isoform被降解了，所以也没啥副作用（除了多耗了点能量）。 |
|
n******e
发帖数: 110 | 35 能不能举一个这样的实际的例子呢? 或者给个ref,非常感兴趣这样的调节机制 |
|
|
|
n******e
发帖数: 110 | 38 感谢回复!
如果楼主的情况是NMD引起的话,那么如果用药物抑制NMD应该能检测到表达了吧. |
|
h******y
发帖数: 351 | 39 我的建议是，在和老板争论是否有deletion之前，利用其他的办法证实你的PCR所发现
的结果。PCR是很容易出错的，如果你能利用Southern证实homozygous的deletion确实
存在，相信你的老板是会接受你的结论的。
Constance L. Cepko实验室最近retract了G&D上的一篇文章，很好的说明了PCR的易错
性。有兴趣的可以看看。
http://genesdev.cshlp.org.mutex.gmu.edu/content/25/12/1344.long
“We are writing to clarify the interpretation of the results from our above
-mentioned paper. In this study, we used two methods to examine the
structure of RNA from the mouse Math5 (Atoh7) locus. Our initial
characterization was an analysis of the Math... 阅读全帖 |
|
x******e
发帖数: 1428 | 40 多谢啊！
不过我刚才列出来的是一个transcript的信息，每一个transcript都有不一样的UTR信
息的，所以应该不是“possible differential 3' UTR among all the transcripts”
。不过你的话提醒我了，我猜是alternative splicing可能有不同的UTR？不过我也是
瞎猜的……
Anyway了，我先把两段加起来算总的UTR的长度吧。 |
|
c********b
发帖数: 363 | 41 I feel it is not easy to conclude with current knowledge.
I knew two reference:
1, Mature blood cell has a capacity for splicing, even without nucleus.
This is on a 2005 Science paper
2, Last year, people showed mature blood cell has some sort of circadian
rhythm, suggesting that circadian is not maintained at transcription level,
but post transcriptional level. Last year one Science paper.
So our current knowledge may not be enough to explain. |
|
s******y
发帖数: 137 | 42 如果只是RNA表达的差异上不一定现在要跳deep sequence，比起microarry来说在一般
模式生物上没有太大优势。但是缺点是如果同样一组做三个重复价钱要贵不少（bar
coding 还是比较麻烦而且又多一层bias）。而且现在没有太好的分析软件，如果没有
一定的command line的经验的话分析起来还是比较费劲的。
deep sequence还是在非模式生物和一些比较特定的实验设计（alternative splicing,
allele specific expresion，etc)下优势比较明显吧。
just my two cents. |
|
s******s
发帖数: 13035 | 43 microarry做出来的数据最后还要qPCR验证，如果基因多的话费时费事费钱。
RNA-seq和qPCR基本上完全吻合，做出来数据不需要validate, 而且不同实验室
不同时间做出来的数据也方便比较
splicing, |
|
n******7
发帖数: 12463 | 44
没做过实验，只是好奇deep seq需要重复吗？ 感觉重复就等于多了点coverage而已
splicing, |
|
|
i*****g
发帖数: 11893 | 46 很有意思，看见这么多人在说这个想法。
这个想法我在2005年1月之前，换实验室时，和PI说了，他听不懂这张PPT意味什么。
后来我又换了实验室，2007年（2008？）某天新老板和我听完某个不相关的seminar，
和我说起这个，他才开口说了2句，我就知道他想说什么，
他的反应是，i have not finished my briefing yet, you really understand my
point? 于是就和他说，of course i know what you want to do,然后讨论了半天，原
来他的朋友有这个想法 etc etc，后来我又做了一些Homework，还是决定放弃。这个很
不好做，估计是个死途。
这个技术最大意义是：能找到locus specific DNA-protein complexes。目前的通行做
法是，已知某个protein, 你用CHIP，证明在某个Locus上面，然后开始making story，
编剧。但其实，那个Locus上面可能有几十种特殊蛋白在调控！！！
2004年底，我的想法来源于推广TAP+MS，我已知 TAP+MS... 阅读全帖 |
|
y*********u
发帖数: 183 | 47 在研究一个蛋白
文献报道有两个isoform ，A和B
isoform A所有exon都表达
isoform B发生了两个splicing event
我现在疑问的地方就是觉得可能存在另外两个isoform ：因为从序列特性上来说，两个
spicing event都可以独立发生
在这种情况下，要去哪些数据库中dig out可能的spicing event 呢？ |
|
m******5
发帖数: 1383 | 48 我现在也在这么设计 ， 不过我们实验室之前已经有很多默认两个splicing event同
时发生情况下设计的工作了……现在特别害怕其实这两个event是独立的，有一种start
over的感觉……很不爽 |
|
e*****t
发帖数: 642 | 49 oh hell,there are so many software available. i used to use maq,it's quite
reliable. but it's slow...
now many ppl use bowtie, it's fast and memory economic because it's special
algorithm. you can even run it on pc. for RNA-seq, some ppl use tophat if
you want to align on splicing junction... |
|
y*********u
发帖数: 183 | 50 that is also how I figured it, I designed such a knock in animal by
replacing the whole exon1 and exon2 (keep some flanking sequence as splicing
context) without additional polyA signal. I am hoping it would work
binding |
|
