h*********y
发帖数: 79 | 1 感谢楼上几位兄弟支招，现总结并讨论如下
(1). biotin技术(基于Crosslinking的Lable transfer方法)
感觉应该是应用于细胞内。本人使用的是体外重组蛋白
(2). microscale thermophoresis
没做过MST，仅知道MST能计算Kd，是否也能定量计算分子量或者结合比？有没有做过的
牛人帮我介绍一下？
(3). NMR
蛋白分子量太大。。。
(4). Size exclusion chromatography-multi-angle dynamic light scattering (SEC
-MALS)
从本人实验来看，蛋白A为10KD，配体B蛋白120KD，该方法测定的分子量精度不足以区
分120KD上添加了几个10KD。
(5). 不同的荧光技术（FRET, BRET, Quenching, PF）
如(4)，不知道如何定量。
(6).ETH有个人专门做蛋白组的，可以分离protein complexes，这个或许相关
分离不成问题，关键是定分子量。。。
除了以上建议，另外有朋友建议用Beckman 分析定量超速离心机 Beckma... 阅读全帖 |
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g*******f
发帖数: 427 | 2 我想用一个蛋白的抗体来免疫沉淀这个蛋白，目的是要从组织中富集这个蛋白用来做质
谱看它的在体内的修饰情况。
我用抗体沉淀蛋白后，加dynabeads protein G,洗脱后跑western blot 看蛋白有没有
被沉淀下来。western blot用做IP的抗体检测，发现在55KDa有非常强的带，但是我的
目的蛋白是40KDa, 这个带应该不是protein G，因为protein G 只有17 kDa。 我想请
问这个带会是什么呢？用什么抗体做western blot 来检测这个ip 后的产物比较好？
多谢了 |
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H***3
发帖数: 61 | 3 研究对象是原核生物cyanobacteria，通过标记一个蛋白GFP，看细胞内定位改变。野生
型里，破碎细胞后15000g离心GFP蛋白在上清。突变一个基因后，GFP蛋白定位变了，可
是破碎细胞后即使300g离心，GFP蛋白也在pellet里。现在需要做SDS和native gel分析
GFP蛋白的表达量和大聚合体分子量。可是问题是，如果做total protein loading不离
心，完全跑不进去空。我怀疑，这个基因突变以后，细胞代谢紊乱，产生了很多不知道
什么东西（多糖？），导致GFP蛋白被包裹，一般的detergent，boiling都除不掉。不
知道大家有没有建议？怎么除多糖？或starch？如果跟cytoskeleton结合紧密，怎么除
比较好？多谢 |
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B***v
发帖数: 113 | 4 1. 现在质谱的灵敏度有多高了，一个蛋白只有20 ng的话可以检测到吗？我记得以前起
码需要coomassie blue能看到的蛋白才行。
2. 用质谱做全细胞proteomics定量，信号是否很难解析？因为一些house keeping
protein量太大，会干扰其他量低的蛋白的信号？
3. 用质谱比较两个蛋白的表达量是否准确，比如说信号强度1:5，蛋白量也是1:5？我
以前的经验是蛋白量远大于这个比例，比如1:100 |
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e*******6
发帖数: 72 | 6 安必奇生物科技有限公司是一家新兴的生物产品研发服务的公司，成立于2005年，总部
Creative Dynamics 位于美国纽约州，是一家创新型企业。公司依托深厚的国际资源背
景、经验丰富的留美科研人员致力于生物产品和化学产品的研发服务，在北京、成都、
西安、兰州均设立有子公司，并继续在全国各地（如天津、武汉等城市）兴建子公司，
最终做到公司布局全国化。公司坚持以美国总公司为主导，子公司专业经营的联合运营
体系作为公司高效运营的组织基础，经过几年的不懈努力，公司已初具规模，目前已为
300多家国际领先的制药公司和科研机构提供产品和服务，客户遍布欧美、日本、新加
坡等各个国家，我们奋斗的目标是创立自己的企业品牌，成为全球知名药企。
在这里，您能用您所长，也能补您所短；
在这里，您能赢得现在，也能成就未来。
无论您初出茅庐，还是行家里手，只要您出类拔萃，这里有无数精英共成长；
无论您远渡重洋，还是心系家乡，只要您志存高远，这里有广阔天地任翱翔！
员工福利待遇：
1、享受公司各项福利补贴；
2、享受五险一金；
3、享受年假；
4、员工活动
5、员工体检
6、定期组织海外实习培训；
7、参加... 阅读全帖 |
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e*******6
发帖数: 72 | 7 安必奇生物科技有限公司是一家新兴的生物产品研发服务的公司，成立于2005年，总部
Creative Dynamics 位于美国纽约州，是一家创新型企业。公司依托深厚的国际资源背
景、经验丰富的留美科研人员致力于生物产品和化学产品的研发服务，在北京、成都、
西安、兰州均设立有子公司，并继续在全国各地（如天津、武汉等城市）兴建子公司，
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s********8
发帖数: 18 | 8 生物招聘职位如下：
胶体金类产品项目经理
岗位职责：
1. 负责胶体金生物诊断/检测试剂卡/试剂卡耗材/生物活性原料产品市场调研工作
，了解胶体金类产品研发最新进展，收集国内外优质生厂商胶体类产品信息；
2. 负责与胶体金产品国内外优质生厂商联系，洽谈OEM合作，采集产品相关信息和
数据处理；
3. 为海外客户提供优质高效的产品售前售后技术支持工作，维护目标客户；
4. 制定工作计划，定期进行工作总结. 完成公司规定的国际业务相关的各项工作任
务；
职位要求：
1. 免疫学. 生物化学. 细胞生物学. 分子生物学. 检验医学等专业的等相关专业，
硕士以上学历；
2. 具有实验室项目研究经验，要求有较强的免疫学. 分子生物学实验操作水平及专
业理论；
3. 具有胶体金类生物诊断/检测试剂卡产品开发经验；熟悉胶体金试剂卡行业发展
状况；有实际的传染病. 代谢物. 农残. 药残等试剂卡开发经验者优先；
4. 英语六级水平以上，能够熟练进行英语交流和报告写作，能以英语作为工作语言
与国外客户进行无障碍交流，熟练掌握Office 2010办公软件；... 阅读全帖 |
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m****m
发帖数: 395 | 9 求审稿机会，膜蛋白、不可溶性蛋白、可溶性蛋白，X射线晶体衍射、核磁共振，结构
生物学、蛋白结构与功能、蛋白表达和纯化技术
站内联系，多谢！！
邮箱： [email protected]/* */ |
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m****m
发帖数: 395 | 10 求审稿机会，膜蛋白、不可溶性蛋白、可溶性蛋白，X射线晶体衍射、核磁共振，结构
生物学、蛋白结构与功能、蛋白表达和纯化技术
站内联系，多谢！！
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c********d
发帖数: 11593 | 11 记得版上之前就有关于单吃蛋白不吃蛋黄的讨论。貌似在减肥期间，吃蛋白丢蛋黄是个
常见做法；而我这么做还有更充分的理由——先天性高血脂。
不过，很偶尔地想起来一件事：红楼梦里的妹子们是拿鸡蛋洗头发的。
然后上网一搜，好家伙，搜出来好几个鸡蛋洗头的recipe。看来不仅仅是老中，很多老
美也这么做。这样一来，本来该进垃圾桶的蛋黄似乎就有更好的去处了。
网上配方如下：蛋黄一个，椰子油一勺，打成乳状，敷头发半小时，洗发水洗掉。
据那个作者说，“头发上会留下淡淡的椰子香”。
正好，椰子油似乎也是本版推荐过的烹饪用油之一。所以买了一罐organic椰子油，试
着做了几次蛋黄发膜，感受如下。
1、椰子油没有味道的！什么椰子香就别想了。滴几滴柠檬精油压一压蛋黄的腥味是正
经，事后头发上留下淡淡的柠檬香也不错。= =
2、蛋黄比蛋白稍微耐高温一点，据说蛋白护发之后用热水冲洗很容易留下满脑袋蛋花
，目前感觉蛋黄还没这个问题，平时淋浴的温度就可以了。
3、效果的确很不错，洗完头发以后头发会变得比较顺而且亮。
4、我的头发是长到后背中间的位置，所以事实上每次需要两个蛋黄两勺椰子油。
5、蛋白对上等量鸡汤搅匀，微... 阅读全帖 |
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y****t
发帖数: 172 | 12 最近做IP拉下来一个比较有兴趣的蛋白X，测序结果发现其与一个已知蛋白Y的C-末端片
段序列相同。现在想设计些试验来搞清楚这个蛋白X是个独立存在的蛋白呢? 还是来自
蛋白Y? 以前没做过类似的工作，没有思路。那位大侠给指点一下用什么方法和手段能
解决这个问题？非常非常感谢！ |
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v*********i
发帖数: 40 | 13 是的耶。其实根据原理自己也能判断我的做法应该没问题；而且以前、别人都是这么做
的。
我郁闷的是老板说我这么做不对，还指责我，还说你要是不会做就问问其他人，看看人
家是怎么做的。可是我明明会做，而且做的是对的。
所以想发上来让大家评评理。
我直接加SDS PAGE loading buffer到PBS悬起来的细胞里面煮，老板一听就说怎么能这
么做，你这么做是错的……不能用SDS loading buffer，这个是跑胶的时候上样用的，
你提细胞里的蛋白得用RIPA buffer。
还说，你怎么不加蛋白酶抑制剂。我解释说里面有高浓度的SDS，再煮过，不需要加蛋
白酶抑制剂了，因为蛋白酶已经变性了呀（我的解释对不对??????）
可是老板说做蛋白都得加蛋白酶抑制剂，你不是说自己以前做过很多蛋白质实验吗，你
要是没做过就说没做过，我可以让其他人教你，你要是不知道怎么做，要主动问别人，
看看人家怎么做的，等等。
还说，你怎么不测蛋白浓度；我就解释说我觉得不需要测蛋白浓度，以前我都不测，因
为转染的时候起始细胞数量是一样的，蛋白量应该差不多，加actin内参看一看就应该
知道平不平了；另外加了SD |
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n**********1
发帖数: 251 | 14 对于实验刚刚入门，因为实验需要，要提取不同细胞部分的蛋白，比如总蛋白，膜
表面蛋白，膜蛋白，胞浆蛋白和核蛋白，大致的原理和具体的方法不是很了解，希望高
手能够指点一二，尽快上手，非常感谢了啊。 |
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m****m
发帖数: 395 | 15 做好的膜蛋白脂质体样品，需要用extruder过滤一下，该膜蛋白有疏水部分，也有一半
以上亲水部分，请问那个滤膜会不会吸附蛋白呢？很担心损失样品。
在用透析方法做脂质体的时候，还发现一半蛋白进入不了磷脂形成脂质体，而是溶在缓
冲液里，造成大量浪费，这是什么原因呢？该怎么样解决一下啊？想听听大家的意见想
法 |
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l*******k
发帖数: 361 | 16 先透析，去掉imidazole， glycerol 5-10%, protease inhibitor不是必须的，可以加
一点EDTA, 1mM, 绝大部分serine protease没有Mg离子都没有活性了，有的蛋白要加DTT或者beta mecapitalmethanol,保持溶液的还原状态，视情况而定。
然后分装，用液氮进行迅速冷却，然后保存在-80, 有些比较脆弱的蛋白即使这样保存也会失活，那就需要找到合适的buffer，或者每次都用fresh made的蛋白
推荐你去读一下一个科大师兄写的从纯化到星辰，里面提到了很多蛋白提纯跟保存的技
术，对于做蛋白的很有帮助 |
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r*******i
发帖数: 112 | 17 glycerol 是蛋白稳定剂（因蛋白而异）并能保护蛋白在急冻时候少受破坏 >=5%才有用
imidazole 是弱的denaturant, 很多蛋白不喜欢
EDTA 是金属chelator, 如果你的蛋白里没有金属,应该没有伤害,但也没什么用,因为在
提纯中用EDTA 可以抑制金属蛋白酶
很多时候100mM KCl (or NaCl, (NH4)2SO4)with/without 50 mM Arg 增加可溶性和稳
定性, 原理很有争议, 也有用 Arg + Asp
最后, 浓缩,离心,分装,急冻 (N2 liquid), -80
or 50%glycerol -20 |
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m****m
发帖数: 395 | 18 膜蛋白难表达是很正常的事。
先把各种可能性一一排除，然后确定原因。各个击破。一次改变一个条件，一次解决一
个疑问。
关于测序的事，如果可以的话，还是想想办法做一下。
先从涂板开始，每个菌落小量摇菌，检测质粒的存在，还有生长活性。标记好有质粒的
菌，挑选最有活力的菌进一步做表达蛋白，有几个问题需要解决：OD生长到多少的时候
开始换培养基最好？（一般是对数生长期吧，不过自己也可以试一下在不同生长期）。
更换培养基后，多久以后开始诱导？（我一般是1个小时以后，不过你可能不同，要试
一下）。分几个不同的温度进行诱导（更换培养基后就用这个温度）、诱导多久后膜蛋
白表达量最高？（这个就要麻烦你要每隔一段时间取点菌去测一下有没有蛋白了）最后
决定最佳诱导温度和时间，还有你说的IPTG量的问题，也可以试一下，抗生素的浓度也
要控制好，太高菌就不长了，太低么要长杂菌。最后裂解细菌，看你用什么方法了，裂
解完离心后膜蛋白有可能在上清液里，也有可能在PELLET里。确定这个以后，就可以开
始纯化了。总之每个步骤都要严格监控，别把蛋白弄丢了。
小小建议呈上，希望对你有所帮助，祝你成功~ 实在不行，最后可以去做 |
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h**********d
发帖数: 30 | 19 好的，我也只好一个一个条件慢慢尝试了。
我是让colony在2YT里长到饱和（1.5到两天）后转入M63培养基的，这个以前也是成功
的，并
且是参照文献上类似工作做的。我一般都是从板上挑最大的几个菌落开始长，当然它们
也是长
得最快的。开始诱导都是在E.COLI进入600纳米吸收值0.6到0.7之间（我个人觉得OD高
一些有
利于细胞内低GLUCOSE，高cAMP两个条件满足引发表达，是这样么？）。
我从来没尝试过降低温度表达，因为实验室用的E.COLI C43是专门优化表达细胞色素氧
化酶这
类的膜蛋白的，我这次打算用37，30，25都尝试一下？
诱导后一半长菌4个小时，久了会形成干扰的杂质蛋白CYTOCHROME OO3,大概1，两个小
时黄色
的E.COLI就会开始变红，意味着蛋白已经积累到可以目测的程度了。
蛋白的纯化我到不担心，这个在组里已经是很常规的步骤了，首先它都在膜里的，不会
在清液
中，其次有没有蛋白从颜色就可以看出来，棕红的细胞膜就对了，呵呵。 |
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a*****3
发帖数: 565 | 20 想请教纯化蛋白的专家几个问题
1,用Ni-NTA亲和层析柱纯化蛋白，收集到的样品是带有完整的6xhis序列的蛋白
还是洗的时候被洗脱了。
2,有没有人碰到过纯化蛋白没有活性的情况？听说还是很有可能的。
3,如果有可能失活，哪类蛋白比较容易过柱后失去活性呢？
先谢谢了 |
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o*****n
发帖数: 445 | 21 现在在e coli里表达一个蛋白，这个蛋白序列里有cystein。我想知道蛋白纯化时需不
需要加入dtt.
蛋白是neuron dendrites里的一个蛋白,不知道dendrite里是不是reducing
environment?
谢谢。 |
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l*******e
发帖数: 214 | 22 【 以下文字转载自 Chemistry 讨论区 】
发信人: lovetheme (lovetheme), 信区: Chemistry
标 题: 请教：LCMS某蛋白发现Ｎ多species
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Oct 28 23:32:04 2010, 美东)
lcms某一蛋白，结果显示有大概二十几种species，质量在几十至几百Da以内浮动。蛋
白是在tris buffer里面的。sds page结果看不出异样，请问这种情况可能会是哪些原
因造成的？因为我的目的是想金属标记该蛋白(蛋白本身未加标记)，这么多species一出来，都不知道这
蛋白到底是标记上了还是没有标记上。
谢谢。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 23 有几个地方补充一下
2.如果蛋白不纯，比如很多杂带，你怎么确定你要的蛋白在里面？用什么方法？
把符合尺寸的带切下来，送去做质谱
3. 怎么测试蛋白的热稳定性？用什么biopgysics的方法？
一大堆经典方法。自己去查
4. 用质谱测MW，有时有偏离，那么表达后修饰都有那些需要考虑进去？
（不考虑糖基化）
表达后修饰可以直接用质谱来测。只要你告诉对方你有这个需要，他们就会
给你做
5. 怎么确定蛋白是否有糖基化修饰？
质谱是最直接的方法。
6. 蛋白浓缩的时候有沉淀，一般你会怎么办？
严格控制条件，一定要加够DTT. 然后把透析的烧杯密封起来
透析完之后，用高速离心把沉淀成分去掉 |
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U*****t
发帖数: 19 | 24 参考了楼上的答案后给出我回答
酶切+质谱，质谱-质谱应该能确证该蛋白是否存在目标蛋白的片段。
首选 Western Blot；
辅助证明 酶切，看是否产生目标蛋白酶切的片段。
蛋白与它的目标蛋白反应--------- 如用 SPR， Fotebio 等不需纯化好的蛋白
CD， DSC, temperature-dependent fluorescence (有不同称呼 如 Tdf 或
thermFluor）
N-端 去 Met；磷酸化，。。。
质谱-质谱可以 mapping 哪儿进行了修饰
SDS-PAGE 后 Glyco-staining
solubility screening 获得好的溶解条件。一个一个条件地试是比较傻的。 |
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m**z
发帖数: 787 | 25 做结构的lab... NMR的确不一定每个蛋白都能做的。。。可以试试看不同的buffer条件
，包括pH,盐浓度等。我知道NMR对于这些条件的容忍度不是很高，不过还是可以一试。
还有就是你的HSQC是什么温度run的呢？如果只是25度的话，试试看提高温度到35甚至
40度，也许能有好一点的谱也不一定（当然你的蛋白要够稳定。。。）
我不是做结构的，不过我以前一个蛋白也试过NMR,那个时候晶体结构已经有了。25度的
时候也是只有几个peak,40度的时候好很多。后来发现蛋白会形成tetramer.可能提高温
度有利于某一种state,所以能看到不少峰。我们认为应该就是这个tetramer...这样的
话就是一个45kDa的分子。后来有人还试过full deuteration.谱又好了很多，不过还是
不ideal...现在不知道还有没有人再努力。。。所以我觉得有时候NMR条件的优化是得
益于你对这个蛋白性质的了解得。
或者能不能同时也试试看crystal呢？也许能多一点机会。 |
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s********n
发帖数: 2939 | 26 我大概查了一下，Brown U好像可以做到-150 to 160 C，还有其他几个Universities也
可以做。
有几个问题想请教一下：
1. 文章提到他们的蛋白用N15, C13 label，有的用D2/C13 label，这是两个实验么？
还是说这个蛋白需要用三种标记？
2. 用D2/C13 label的蛋白在纯化过程中用的是普通的水还是D2O?
3. N15/C13 label的蛋白纯化需要用特殊的试剂么？比如说是否需要杜绝带有N14/C12
的试剂？
4. 整个过程如果顺利的话需要多少时间？我在考虑是否值得花这么大的力气去做。
H，靠的是J-
度会慢很多。别
蛋白（寡聚）， |
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m********r
发帖数: 124 | 27 Btw,你的蛋白在我眼里已经很纯了，250或者 500的盐都是，我都不好意思上我的胶图
了，我的融合蛋白量（25KD）在全菌裂解里也有70%以上是目标蛋白，但是到了咪唑洗
脱就成了40%的样子，主要就是在10-15KD有两个很大量的杂蛋白。这个让我感觉是降解
的；
GST 我有另一个麻烦，就是free GST很多，摇再多的菌，也有一半以上的GST 结合到
beads上，fusion protein相对结合的少啊，这也是我GST表达一直没解决的问题。
至于说离子交换，我还没试。但我想尝试上来就用它，而不是Ni之后。我们没有mono的
，都是大体积的。不知道有什么要注意的
还有就是大家有没有用那个pET-DUET载体成功表达稳定蛋白的例子啊，我在国内的时候
试过，不是很好用。 |
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m********r
发帖数: 124 | 28 如果要知道binding site不就得做assignment嘛，现在做不了。因为只有1：1的量。加
上我蛋白后看到了几个新的峰，我认为是slow exchange,因为另一个蛋白也有15aa左右
loop，（峰看不到）但我老板说是titration没做完，所以原来的峰没完全消失，我也
不知道谁的对；
我蛋白13KD，加上tag大约25KD，（N端GB1加上linker，his tag之类的不到10KD）。要
是结合在柱上这么牢，我觉得可能就是从我蛋白中间断了，省下个his tag-GB1加上我
蛋白的N端，有可能吗？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 29
这个不是我的意思。
NMR解出来的结构，应该是该蛋白在水作为溶剂中最真实的结构。
你说的那个晶体中解出的作为heterogenity 存在的水分子，其实是共结晶的水，
一般是蛋白里面的盐桥之间的水分子，和作为溶剂的水不是一回事。
研究大蛋白功能的时候，只能看局部一小个区域，而且只能通过一些同位素标记
法间接的看。不但要直接定出一个大蛋白的结构目前不可能，要用NMR直接定出
一个大蛋白的局部区域的具体结构貌似也是不可以的,就是只有间接信息，没有直接信
息。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 30 因为SDS-PAGE其实不是看分子量的可靠方式。
蛋白在胶里跑的速度和结合的SDS的量有关，和蛋白本身的构型也有一定关系。
经典生化里粗略的认为蛋白在SDS里面变性之后都是杆状的，这个对于大部分
蛋白是对的，但是对于某些比较特殊的蛋白并不符合事实。 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 31 刺激前后的细胞抽提膜蛋白，然后IP，跑电泳，银染色。可惜没有特异性东西出来
——这个不奇怪吧，如果蛋白表达什么没有变化只是位置变化了的话
我觉得可以试一下crosslinking
好好选择spacer distance
平时蛋白均匀分布，大概距离多远
选个比那个距离小的spacer
富集的时候就应该能crosslink上了
不过如果蛋白富集区有很多种不同的蛋白的话
分析起来会比较痛苦
也可以选择带s--s的可以reverible的crosslinker
这样跑变性胶就能看
不要做MS
能有多大改
善。 |
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g*****p
发帖数: 451 | 32 技术上又没啥突破
自然做起来辛苦，我看现在做的欢的有五拨思路
1.花个二十年建改造技术（只对某种膜蛋白适用），并花力气搞个自动化筛选平台，专
攻一类膜蛋白。有了结果以后可以以技术优势，继续发几个结构挖几桶金。当然等大家
都学会了就没有太大优势了。不过这还是很牛的。
2.搞大工厂，搞个百八十号人。用传统方法用人海战术筛好做的做，只要有1-2篇cns交
帐就ok.当然剩下的都是炮灰
3.从低等生物做起。比如细菌什么的，因为蛋白相对而言表达、稳定性和复杂程度还是
比真核生物强点。这种呢有些结构还是非常重要的，但还有很多也就是些没人care的东
西，
不过膜蛋白相对而言还是比较难做，文章可以顶着膜蛋白的光环跟cns editor讨论一下
，发出来还是有指望的。不过讲工作的时候就没啥意思了，一般会在新闻里吹吹自己发
了cns,虽然没啥意义。
4.经常去开会和打听消息探听情报，从人家组里“偷”半成品。因为这个东西有时候周
期很长，很多组做了4、5年有了结果，保密工作就不好了。有人就专门去探听这种东西
，偷人家的小trick,然后多上几个人跟人家compete
5.老板有个性有兴趣的，做了几十年的单... 阅读全帖 |
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s*********t
发帖数: 600 | 33 用E coli表达的GST蛋白，自身约50KD，免疫兔子。是切掉GST好，还是不切好？
还有，最后纯化下来的蛋白里面有一些20多K的杂蛋白，量比较大。怎么把我的蛋白和其他蛋白分开，进一步纯化？
多谢指点！ |
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X*******0
发帖数: 134 | 34 某原核蛋白,在其原来的菌里的定位未知,蛋白序列本身找不到信号肽.
在大肠杆菌里表达.由于胞质表达总是包涵体,于是改周质表达.用的是pET26b,就是N端
加了一段pelB信号肽的.问题来了,表达完的蛋白去哪儿找?用哪部分纯化?是用细胞,还
是用培养基上清?问题等价于,蛋白(46kD)会不会大多数穿过细胞壁漏到培养液中.
做生化的,大量提蛋白解结构的,比较容易解答我的问题. |
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X*******0
发帖数: 134 | 35 我要提取的蛋白,带有C端6xHis-Tag,但是挂不上Ni柱,上柱后原封不动地出现在流出液
里,一点都没挂上.
由于必须用带N端pelB信号肽的pET26载体,并且N端靠近活性中心,所以只能把His-Tag放
C端,而且我已经试了放N端,蛋白彻底消失,估计N端Tag导致不稳定,降解了.
那么,除了Ni柱以外还有没有别的比较实用的办法纯化这个蛋白呢?我要用它作酶活鉴定
,所以需要纯化分离.蛋白大小在46kD.理论pI6.9. |
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S******e
发帖数: 393 | 36 一个蛋白有没有可能有多个binding sites 与另一个蛋白binding？
我将蛋白A分成4段(no overlap)去做与B的binding,结果显示只有蛋白A的C端那个fragment与B没有binding, 其它3个fragments都与B有binding,这可能吗？
还是我IP有问题？ (A的每个fragments都约70kD以上)
顺便再问一下大家做co-IP都用多少总蛋白以及binding多久？
非常感谢！ |
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g******a
发帖数: 63 | 37 最近在做Chromatin IP, 以前都做转录因子结合DNA，一般先做个预测，然后蛋白拉
下来做pcr。老板说想看下转录因子结合后，组蛋白在该基因启动子区域结合的变化。
我想请教一下组蛋白结合在DNA启动子上的什么区域，好方便设计引物？是ATG
start codon附近还是TATA box之类的呢？
另外，如果我选一个促进的，一个抑制的组蛋白，可以选H3K9Ac和H3K9Me2/
H3K27Me2的antibody吗？
以前没有做过组蛋白的问题，请熟手不吝赐教，感激不尽。 |
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s*********t
发帖数: 600 | 38 透析和直接稀释区别何在？文献上都是透析。
比如抽提细胞系的细胞质和核蛋白纯化complex，我一直是这么做的：
harvest 细胞。加5倍细胞pellet体积的低盐溶液（20mM KCl），冰上放10分钟，用
homogenizer捣12次（用tight的B型活塞），3500 rpm离心10min，上清取出，加0.11倍
体积的1.4M KCl，使得终浓度成100mM，我看文献上说要10万g离心若干小时。可是我们这没有这
样的离心机。只能最大速度（5万G）离心1h，作为细胞质抽提物
S100，分装后液氮速冻，-80保存。这一步很难，因为不管离心多久，都有脂状物质悬浮着，得到的
是浑浊的东西。
对于pellet，加两倍体积的420mM KCl。用homogenizer捣若干下，把鼻涕状黏糊糊的东
西充分散开。然后4度摇30min-1h。然后1万2千g离心30min，分装后液氮速冻，再放-80
，作为nuclear extract。
不知道液氮速冻这一步对于防止蛋白变性有好处，还是别的原因？为何需要速冻？
如果用于蛋白复合物的纯化，我以前是用300mM的盐。但是boss让我改成250mM... 阅读全帖 |
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s******y
发帖数: 28562 | 39 我们现在需要设计一个linker system, 需要在两个蛋白之间放进一串小
蛋白来调整那两个蛋白的距离。要求长度可调（就是可以靠放进蛋白的数量来
调节linker 的长度）。我知道别人做类似的事情的时候会放进titin I27 domain,
但是现在的问题是我们要求这个可以调节的单位长度必须在 50 Aa以内，而
titin I27 domain正好比这个大一倍。
我不知道有什么蛋白的domain 是符合这个要求的？请大家推荐一下?就是必须能够
在５０Aa之内自发折叠成型（最好是球形），而且不要有太明显的功能区域（比方
说有个什么什么binding domain 就大大的不好）的东西。必须在５０个氨基酸内，
但也不要太短，6xHis 这种就太短了。２０～５０Aa最好。
谢谢！ |
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l******n
发帖数: 143 | 40 象前面同学推荐的,光谱类的快速,简单,直接.作为首选很合适.
(1).Fluorescence Emission,最简单的看看tyrosine, tryptophan的化学环境有没有因
为Mg结合而变化,从而对荧光有影响.
(2).同时可以尝试Circular Dichroism,最简单的蛋白二级结构,如果不追究变化的源头
,而只是用变化作为信号去测量金属离子和蛋白作用的,很简单方便.
以上两个方法典型的应用有很多,比如calmodulin和钙离子作用.
注意:因为你需要测的是chemical equilibrium,如果反应很慢的话,需要保证滴定过程
每个滴定点(浓度)都要达到化学反应平衡.
SPR
这个不适合,首先是因为信号来自bulk solution(流动的溶液)中的分子被吸附到固定在
表面的蛋白上形成复合物,本质上因为质量吸附造成sensor surface附近媒介的折射率
改变.所以被吸附的质量大小直接影响了信号强弱.你的实验是Mg在bulk solution,这么
小的离子,几乎不可能产生什么明显的信号.这也是ligand-protein binding里很少用
SPR的... 阅读全帖 |
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w*******r
发帖数: 23 | 41 我试验目的是找到药物的靶标。control是beads，实验组是用biotinylated drug pull
down 细胞裂解液中的靶蛋白。在60KD左右发现了一条只出现在pull down sample里的
条带。于是，我把60KD的带切下来送去做质谱。可分析结果中丰度最大的却是一个70多
KD的蛋白，这是怎么回事？如果是个小于60KD的蛋白，那么还可能是翻译后修饰导致的
。但为什么我明明在60KD切下的胶，会有70多KD的蛋白呢？这个蛋白有两个isoform，
都是70多KD，查了文献，也没有什么剪切处理的产物。百思不得其解，求高手解惑。万
分感谢！ |
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t******y
发帖数: 716 | 42 最近做一个蛋白，处理后mRNA 升高了10倍，蛋白量却下降了有将近80%。你们会认为问
题出在哪里？有没有谁碰到类似的情况？
1）蛋白翻译受到抑制，蛋白降解提高。
2）蛋白降解抑制。
为什么细胞需要做这样的调整？
用的细胞是上皮细胞。 |
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b******n
发帖数: 4225 | 43 这里扯开一点，这种异源表达的蛋白能代表多少in vivo蛋白的结构很是问题
过量表达的很多蛋白都或多或少有folding的问题
去年我参加一个年会，一个蛋白结构的学者在台上侃侃而谈他研究的蛋白结构
但是所鉴定的重要位点让台下很多做功能的科学家很不满意
跟现有的实验数据太不吻合了
群起而攻之问得搞结构的很尴尬，无言以对 |
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b******n
发帖数: 4225 | 44 可能蛋白的his-tag被包埋在蛋白里面了
如果不需要有活性的蛋白，直接变形了再去结合Ni-NTA
需要有活性的蛋白就要考虑将His-tag放到蛋白的另外一端试试看 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 45 最近做一个蛋白A
高pI（>9)
已知蛋白A跟蛋白B，或者蛋白B+C有相互作用
于是共表达然后纯化复合物
纯化过程中用detergent啊，lyzosome啊
DNase还有RNase啊
结果破碎细胞以后离心得到的pellet，还有得到的复合物pellet都超级难resuspend的
一整块像Jelly的东西
能弄成大小碎块但是没有办法混匀
用针头反复吸吹也不行
加Uear到5M也不行
参考了一些提纯histone protein的protocol，
加HCl到0.25M也没有办法完全溶解
求建议！ |
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s******y
发帖数: 28562 | 46 这里应该是指用serum free 的培养液来冲调cycloheximide (usually dissolved in
DMSO), 然后再加进原有的培养液里（就是不换液）。在我的经验中这样是可以的，只
要加进去的东西不要超过总体积的20%。
至于说加药到18小时，这个就要赌运气了。在大部分情况下，我不会相信任何超过12个
小时的数据，因为细胞都开始调亡了，谁知道蛋白的变化是什么造成的啊？
对于半衰期特别长的蛋白，标准做法是用同位素标记法。
另外，再多说一句，对于半衰期特别短的蛋白，同位素标记法其实不是一个好方法（除
非是体外转录直接加到反应液体里），因为标记需要至少半个小时到一个小时，其实并
不是一个真正的instant pulse，再加上immune pulldown 本来就不是容易重复的量化
手段（实验的随机误差很大），对于短寿命的蛋白测出来的数值很不可靠。所以这个方
法只对于比较长寿命的蛋白适用。
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b******n
发帖数: 4225 | 47 非特异性条带的可能性比较大
如果是原核细胞中产生的重组蛋白作为抗原打动物产生的
那么非特异性的条带的可能性比较小
如果是直接哺乳动物细胞过量表达的重组蛋白或者endogenous protein提纯后作为抗原
注射动物产生的抗体，因为纯化工序的原因不是很纯，有少量背景蛋白存在，得到的血
清中非特异性条带可能性很大了
还有一种可能是同源区域，就是目的蛋白A的一部分序列在另外一个蛋白B也存在，或者
相近
你实在感兴趣做pull down然后割胶送去测序：） |
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e********r
发帖数: 147 | 48 我们用最常用His tag + Ni-NTA（未加detergent）纯化到了一个可溶的细菌膜蛋白（
pET30a, 两个跨膜区）。虽然量很少，但有活性。Western blot和MS都鉴定该蛋白是正
确的。我们用这个蛋白做了论文里所有的实验。诱导条件是12度，24小时，0.5 mM
IPTG。
论文审稿后问题不大，但有个审稿意见让我们说明一下是“怎么纯化得到膜蛋白的”。
我猜专家是做蛋白结构的所以觉得很意外，但我怎么回答他比较合适呢？总不能说“我
纯化到了，所以我纯化到了吧”，这样审稿人会发怒滴，呵呵。请各位给个合理的建议
，谢谢。 |
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e********r
发帖数: 147 | 49 我们用最常用His tag + Ni-NTA（未加detergent）纯化到了一个可溶的细菌膜蛋白（
pET30a, 两个跨膜区）。虽然量很少，但有活性。Western blot和MS都鉴定该蛋白是正
确的。我们用这个蛋白做了论文里所有的实验。诱导条件是12度，24小时，0.5 mM
IPTG。
论文审稿后问题不大，但有个审稿意见让我们说明一下是“怎么纯化得到膜蛋白的”。
我猜专家是做蛋白结构的所以觉得很意外，但我怎么回答他比较合适呢？总不能说“我
纯化到了，所以我纯化到了吧”，这样审稿人会发怒滴，呵呵。请各位给个合理的建议
，谢谢。 |
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e********r
发帖数: 147 | 50 我们用最常用His tag + Ni-NTA（未加detergent）纯化到了一个可溶的细菌膜蛋白（
pET30a, 两个跨膜区）。虽然量很少，但有活性。Western blot和MS都鉴定该蛋白是正
确的。我们用这个蛋白做了论文里所有的实验。诱导条件是12度，24小时，0.5 mM
IPTG。
论文审稿后问题不大，但有个审稿意见让我们说明一下是“怎么纯化得到膜蛋白的”。
我猜专家是做蛋白结构的所以觉得很意外，但我怎么回答他比较合适呢？总不能说“我
纯化到了，所以我纯化到了吧”，这样审稿人会发怒滴，呵呵。请各位给个合理的建议
，谢谢。 |
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