p********t
发帖数: 411 | 1 看到不少文章中把蛋白的功能都做了一大堆了，且符合大家对这个蛋白特性的共识。但
最后都不能证明这个蛋白在这个组织里确实有表达，至少show个WB的图吧。结果拿个
PCR充个数。这怎么解释呢？就是没有合适抗体？让我如何相信啊。 |
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p********t
发帖数: 411 | 2 看到不少文章中把蛋白的功能都做了一大堆了，且符合大家对这个蛋白特性的共识。但
最后都不能证明这个蛋白在这个组织里确实有表达，至少show个WB的图吧。结果拿个
PCR充个数。这怎么解释呢？就是没有合适抗体？让我如何相信啊。 |
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C**S
发帖数: 522 | 3 没人做过这个蛋白和任何骨架作用，我查到的关于这个骨架蛋白spectrin本身的文章都
很少。 |
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C**S
发帖数: 522 | 4 我们老板对什么都感兴趣，除了技术上难做的。所以我们实验室通常也就拿个siRNA干
扰，测个信号通路之类的。到处捡别人剩下的渣吃。
如果是真的，该怎么接下来做？我唯一能想到的就是说这个膜蛋白和spectrin结合，来
控制tumorigenesis。我已经有了这个膜蛋白胞内段不同deletion，在肿瘤细胞
overexpression后肿瘤大小不同的结果。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 5 突然想起了一个问题：
一个蛋白的氨基酸序列，如果颠倒过来排（就是把C-terminal 的放到
N-terminal 去），产生的蛋白和原蛋白有什么关系？
镜像关系？手性关系？还是没有关系？ |
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s*******m
发帖数: 24 | 6 需要大量纯化一个小蛋白，大概9KD左右。在大肠杆菌里面表达量一直不高。以前看过
一篇文章，说需要在蛋白N端第2个或者第3个氨基酸做一个突变，可以提高表达量。有
谁知道是什么突变不？或者有谁知道怎么在细菌里面大量表达小蛋白的办法不？多谢了
！ |
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s*******m
发帖数: 24 | 7 以前有一篇文章，专门讲小蛋白的。据说一般情况下，小蛋白在细菌里面表达量都比较
低。好像是因为容易被降解。但是要是在第2或者第3个氨基酸的位置放一个特定的氨基
酸，就可以保护蛋白不被降解。不过我怎么也找不到那个文章了。。。。 |
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l***g
发帖数: 19 | 8 也试过切gst，但是切后纯化，再去掉factor xa，所得到的蛋白实在太少了，想用
precision来切只要一步就能纯化加去掉蛋白酶，用pGEX6p-3载体做的gst蛋白表达量又
比pGEX5的少了好几倍，还降解的很厉害。我也觉得不用再考虑别的tag了，别的文献上
都是用GST tag的蛋白来做我的这个in vitro GTPase assay的，但是合作的实验室就非
要去掉tag，或者用his的，就为这点事情耽误了快2个月了，急死我了，实验就差最后
这一个了 |
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W*********e
发帖数: 247 | 9 GST可以二聚, 有可能是二聚促进了pulldown和酶活. :)
但是没理由6p3载体表达出来的比5的少, 还降解
也试过切gst，但是切后纯化，再去掉factor xa，所得到的蛋白实在太少了，想用
precision来切只要一步就能纯化加去掉蛋白酶，用pGEX6p-3载体做的gst蛋白表达量又
比pGEX5的少了好几倍，还降解的很厉害。我也觉得不用再考虑别的tag了，别的文献上
都是用GST tag的蛋白来做我的这个in vitro GTPase assay的，但是合作的实验室就非
要去掉tag，或者用his的，就为这点事情耽误了快2个月了，急死我了，实验就差最后
这一个了 |
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M*******C
发帖数: 183 | 10 当我用含1-2% SDS 的lysis buffer收的蛋白，就没法用平时的那种Biorad的棕色那个
来定量了，因为有SDS的lysate加进去就变绿了。 想重新根据波长制作曲线，但失败了
，就是说在试不同的蛋白梯度做曲线时，蛋白量太大呢，有时甚至变成深蓝。。 反正
乱七八糟的。
多谢！ |
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y******n
发帖数: 8667 | 11 最近出来的胶，总是不能显示大于70kd的所有蛋白。看标准蛋白，发现大分子量的片段
分成数份混杂在小分子量的片段中间。（因为我们用的标准蛋白中的72kd 带是红色的
。可以看到红色分成了３份，混在20-50kd片段中间。）
有没有什么建议，哪里有可能出问题了？ |
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C*****h
发帖数: 926 | 12 用lentivirus去overexpress蛋白，是很难的。
单个细胞最多接受几个virus，基本上不会有多少蛋白表达（很难检测到）。
在mammalian cells里，蛋白表达本来就不是高效的。
用质粒直接转染，每个细胞接受几万个copies，蛋白质表达都不是很高，
区区一两个virus能在细胞里表达多少蛋白质？ |
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g******a
发帖数: 63 | 13 谢谢ls回帖，我就是做传统的chromatin ip，最后用realtime或者用普通pcr跑胶看条
带。原来组蛋白everywhere？那一般怎么看DNA上的组蛋白数量，种类和状态？用组蛋
白抗体拉下dna后，用引物扩什么特别的序列，可以得到阳性结果？我对组蛋白实在是
不了解，见笑了！ |
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x**2
发帖数: 255 | 14 有些蛋白和其他蛋白结合后更稳定
有些蛋白在特定盐浓度条件下更稳定
其他的大家补充，谢谢～ |
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i*****i
发帖数: 154 | 15 没有仔细研究过荧光蛋白。
但是绝大部分的荧光蛋白和荧光染料如Alexa 488，594之类的都会有Excitation 和
Emission spectra，这个光谱是连续的概念。如附件一样，都是一个钟形的peak。当然
用峰值波长激发是最有效的，但是附近波长的光也会有一定程度的激发。也有一些荧光
蛋白或者染料的Excitation光谱不是非常的光滑，会形成一个类似的次要峰。 但是目
前我看到的荧光染料而言，还没有看到有两个等高的Excitation波长的。
一般来讲Excitation 和Emission的波长相距不远，488已经是标准的绿色范围了，如果
这样讲就是dsgreen，而不是dsred了。
我觉得看波普是最靠谱的，Invitrogen的molecular probe是很值得一看的。
个人愚见。 |
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s**********a
发帖数: 92 | 16 大家好，
对于病毒载体，也像一般plasmid那样，瞬时转染后提蛋白，做western鉴定么？
还是收集上清直接做infection，然后再western鉴定呢？谢谢！
我的情况是：pBABE载体，瞬时转染293后，提蛋白，做western没蛋白表达。 |
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u**********d
发帖数: 573 | 17 nice！
可以关注下这个蛋白的同源蛋白的功能 |
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h******y
发帖数: 351 | 18 请教大家，我想找一个膜蛋白A（最好膜蛋白A的表达具有细胞特异性），可以帮助非膜
蛋白B定位在细胞外膜上。请专家给介绍几个例子。
多谢！ |
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n***w
发帖数: 2405 | 19 搭车问一下，最近在转差不多300kD的蛋白，用湿法转，
试了几个条件，
1. CAPS transfer buffer (10% MeOH), PVDF (precast gel), 400mA 1 hour. 结果是
ladder的top 4 bands 还留了相当一部分在胶上，胶也开始变形了，但是immunoblot还
是能出来不少蛋白。
2. 3 都是改变电流和时间，结果还是会有ladder在胶上。
4. tris/glycine transfer buffer, no MeOH, 转的时间差不多，Ladder也没有全都过
去，虽然也能image出来需要的蛋白，虽然有点弱。。。
版上有经验的建议是湿法30v转overnight? |
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a*******a
发帖数: 4233 | 20 湿转260-270kd的蛋白没什么问题。。当然肯定会有不少蛋白还残留在胶上的，buffer
里面少加一点甲醇就是了。甲醇的作用之一是清除同蛋白结合的SDS， SDS多的话转膜
速度很快，不小心就转到膜后面的纸上了。
个人经验。。 |
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e********r
发帖数: 147 | 21 最近用32P同位素标记的ATP做激酶活性，过程里需要将反应里的ATP完全除去，但保留
被磷酸化的蛋白。ATP需要除得非常干净，避免使后面加的蛋白磷酸化，同时又要除得
快，避免前面被磷酸化蛋白半衰期短。曾经试过用10K的超滤膜多换几次洗涤液，但做
下来要1个多小时，还是嫌时间太长。有熟悉的朋友请介绍介绍，谢谢！ |
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c********b
发帖数: 363 | 22 你不知道，有的蛋白虽然size在30KDa以上，但是fold成杆状，10KDa的都能出来，我试
过手上的这个蛋白，control没有降解，但是蛋白就是渗透出来，不过是size column还
是透析。用太小的size column或者透析的话又不能去掉Triton X100. |
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s******y
发帖数: 28562 | 23 我猜他的意思是有些蛋白提纯的时候会有detergent 带进来，而detergent 本身
因为会形成那种小团状micelle（我为了写那个字都老羞成怒了，不小心就会
被改成michelle），所以个头不小。如果那个蛋白本身也很小的话，用超滤膜就
会出现不能把蛋白和detergent分开的现象。 |
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u**********d
发帖数: 573 | 24 我猜想你的意思是说一个TF的complex可能在DNA上才最终完成装配。不管怎样，之前大
家做IP都是用WCE或者NE，那么调查TF在chromatin上的相互作用蛋白至少是方法上有创
新的，而且原理上我认为也是很有意义的。
如果你的TF和DNA结合弱，那么最好cross-link一下，提取细胞核，破核膜（可以简单
超声或者过注射器针头），得到chromatin沉淀，这样里面残留的游离TF就很少了，然
后用MNase或者超声得到单个nucleosome或者很短的chromatin片段，然后IP。
这个方法的问题也是很大的，就是chromatin上面蛋白太多，要设置好的对照，确保找
到的相互作用蛋白是特异地由你的TF决定才出现在那里，而不是chromatin上的常规蛋
白。找到的candidate也很难进一步做相互作用的验证，in vitro chromatin assembly
这些实验没有一定的积累难以完成。
TF |
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b******n
发帖数: 4225 | 25 有没有取一些柱介质跟2X loading buffer混合之后跑电泳
如果在柱介质中看到大量目的蛋白，说明你的蛋白可能堵在柱子里面了
elution buffer需要添加高浓度蛋白变性剂才能elute下来
40kd的小带可能是molecular chaperone DnaJ |
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b*****o
发帖数: 150 | 26 就是这个道理，这是很正常的。有时候做KO的人没有考虑到去掉EXON后前面和后门的
EXONS还能连在一起。就是碱基数是３的倍数（IN FRAME）。如果是这样的话，有些功
能蛋白去掉一些片段仍然有功能，尽管功能会降低。如果要KO的蛋白功能研究的非常清
楚，这时就要敲除关键的蛋白片段对应的EXON。
domain |
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w*******r
发帖数: 23 | 27 应该不是marker的问题，质谱分析结果里丰度排在那个70KD蛋白下面的就有一个60KD左
右的蛋白还有一个50多KD的蛋白。如果从跑胶结果看的话，那个切下来的条带离70还很
远呢，不可能有70多KD。Anyway, 谢谢回复啊。 |
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w*******r
发帖数: 23 | 28 如果是这样的话，难道这个药同时结合了至少3种蛋白？！因为这个70KD的蛋白和另外
两个60KD的蛋白在control里完全没检测到，只在pull down里才有。 |
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n**********7
发帖数: 29 | 29 大家好。
我最近在用flow检测一种膜蛋白的表达。对于这种蛋白，现有的用于flow的抗体都是
recognize c－terminal的，所以只能做intracellular flow。我的基本步骤是分离细
胞后，加Fc block，fix，permeablize，0.5% BSA block buffer,然后分别染一抗和二
抗，只有single color。
现在遇到的问题是，这种蛋白在treatment之前，不仅在细胞表面有表达，也存在于
intracellular vesicles里，所以不知道permeablize之后会不会检测到的量不仅仅是
表面的表达量。具体应该怎么做才能够保证我仅仅检测到cell surface的量呢？或者除
了flow之外还有其他的方法更适合解决这个问题？
多谢了！
做这个实验有两个多月了，反复试结果都不好，真着急！！ |
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a********g
发帖数: 558 | 30 最近做GST-tag的蛋白纯化，蛋白纯化出来后，在sepharose-４bbeads上切，elusion下
来蛋白总有杂带，一条大概７０kd，一条２７kd后者经检验发现是GST。前者未知，请
大牛们帮忙判断下是什么原因？ |
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p****p
发帖数: 3360 | 31 1. 前面有一个人说得好，要仔细查看是否有alternative splicing导致其他isoform
增多，而你检查的isoform随之下降了。也就是说，看看你检查的mRNA和protein是否来
自同一个isoform。
2. 另外看看你的蛋白是否有转录后调控的功能。看看它是否能反馈调节自己。
3. 你的蛋白是生物钟调控的。你的mRNA，蛋白取样的时间不一样，所以丰度高低也就
不同了。 |
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a********g
发帖数: 558 | 32 最近在做蛋白纯化，发现蛋白很不稳定，用gel filtration分离的时候蛋白总聚集在一
起，只有一个峰，但是SDS-PAGE提示并没有分开，杂带也在里面。
有什么好的方法可以使它变成稳定的单体呢？ |
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a********g
发帖数: 558 | 33 抱歉，也的确是俺没说的很具体，呵呵。
我在纯化一个９kd的蛋白，首先是GST-fusion protein，切掉GST后用Sephadex G-75纯
化，总是在大概６０kd左右有一个大峰，而在目的位置没有峰，或很小的峰。跑胶后发
现大峰里面的蛋白有目的条带也有杂带。小峰是目的条带很纯，但是浓度太低，浓缩后
才能勉强跑胶。
怀疑蛋白自身聚集了，不知道高手有什么好的办法。我目前用的buffer是 500mM NaCl,
50mM Tris-HCl, pH8.5. |
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k****l
发帖数: 279 | 34 我现在要研究一个酶，酶的活性我在 PhD 期间已经验证了，发了第一篇文章
现在Postdoc老板让我做localization，而且找 interacting protein
但我不确定它有没有，我觉得那个酶可以在体外单独起作用了，不一定需要其他蛋白
但老板说 一半的蛋白都和其他蛋白interact，大家觉得这个方向好吗？
谢谢 |
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s*****r
发帖数: 7 | 35 首先，你的蛋白是多位点磷酸化的,先用anti-Pser做IP,不管wild type和mutant可能都
会抓下来,后面的blot还是没区别.
建议：
1 现在有个叫phostag的试剂，可以通过SDS-PAGE条带区别出不同磷酸化状态，在配胶
的时候加入，run gel后用你蛋白的抗体blot，用这个可以粗略分析。
2 如果想知道突变影响的具体磷酸化位点，那可以就把两个蛋白表达纯化出来，typsin
酶解后找个kit（GL sciences，Sigma，Promega等）提取磷酸肽，然后上质谱鉴定各自
的磷酸化位点吧。
IP |
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k****l
发帖数: 279 | 36 有可能你的蛋白 his-tag 已经被降解掉了
可以做Western看看，但是要注意千分之一的蛋白有tag，western也会有信号，所以要
和另一个 his-tag 蛋白比较一下强度
threshold?
bead)？ |
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a*****n
发帖数: 2835 | 37 想做screening，希望能够直接用膜蛋白和分泌蛋白的
library，好像听说过有这样的sub library。请问版上哪位朋友有这方面的信息？多谢！ |
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B******s
发帖数: 52 | 38 你的意思就是，单独的胞外区可以在胞内发挥作用
这个很有可能啊，也有可能很多都可以，取决于，胞外区的protein surface是不是很
容易跟胞内的其他蛋白相互作用。
比如 blast一下蛋白序列，找找有没有与胞外区片段同源的胞内蛋白，或许有些用 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 39 上清有一些复合物吧
SEC的话，蛋白A显示是3聚体，B是6聚体
不过A是3聚体应该不是真的，有别的实验数据显示这个蛋白是非常flexible的长杆子状
的，应该是单体 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 40 大大降低浓度是说纯化以后的蛋白大大降低浓度然后加在一起？
还是说共表达的这一步，比如不加IPTG，同时表达groESL之类的？
忘了说，蛋白A有一个GSTtag的version
用过magnetic beads
一样的，上清液一加到magnetic beads以后
beads立刻变成一整块，完全没有办法吹洗
就好像被什么东西crosslink了一样 |
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s******y
发帖数: 28562 | 41 大大降低浓度是说纯化以后的蛋白大大降低浓度然后加在一起
听起来貌似是你的那个蛋白A有aggregate 的倾向，很有可能是没有完全折叠正确
（当然也有可能是它本来就是这样）， |
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C*******e
发帖数: 4348 | 42 谢谢！
我们的确考虑蛋白A可能就是intrinsically disordered proteins
不过蛋白B，C都是有结构的 |
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s******y
发帖数: 28562 | 43 应该就是Aggregate, 导致带有那些蛋白的bead被胶结到一起了。
如果你的两个蛋白分别表达的时候都可溶而且能够纯化得到纯体的话，
要研究复合体的时候就只好用低浓度溶液，或者用semi solid phase 了。 |
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i*****g
发帖数: 11893 | 44 这个还不错，算有结果了。
很多时候，耗不起，取决于不同的研究目的。不是每个人都可以对某个蛋白折腾上几年
的。
蛋白啊，唉，千人千面，千变万化。不像DNA 千人10面。 |
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z******i
发帖数: 120 | 45 仔细看了一下你的问题，你说的这个分别都挺好，混起来就沉淀，很常见。并非奇葩。
1.A B 是一样的BUFFER 吗？ 不是的话，把A加到B的fuffer里有沉淀不？
2. 给A 和B 全加上SOLUBLE TAG, 比如 MBP 或者更强的 NUSA tag， 不相信你的蛋白
还会沉淀。结构是HELIX BUNDLE 吗？网上预测一下。
3. 蛋白结合DNA/RNA不？ DNAse RNAse 不能除去很彻底。 要用PEI 和 硫酸铵。 另外
，高PI 很容易结合DNA/RNA, 并且在有GST存在的情况下有假结合。这个说来话长。 |
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z******i
发帖数: 120 | 46 看来楼主也是很费了一番功夫的。 俺也就很想能帮上忙。
1.你的A 蛋白是全长吗。不是的话，最好的办法就是加TAG. （最推荐的方法，目前你
还没有试过）
以俺经验，改变CONSTRUCT往往是最有效的。 试试改改。
2. BUFFER TEST 可以进一步做一下: 用CONCENTRATOR 把A.B 都浓缩一下，目的是要
FLOW THROUGH 的buffer。 然后用 A-B buffer ‘B－A BUFFER 再试试看。
3.PEI DNA/RNA， 然后硫酸铵沉淀蛋白，这样才能彻底去除 BOTH DNA/RNA 和 PEI。另
外你说的不知道结合不结合，可以看一下260/280 VALUE，很简单。不要用EB啥的，那
个不准，跟上样量有很大关系 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 47 非常感谢深入讨论！
其实我们现在正在准备做CD
另外有位前辈站内信给我建议
做peptide array先找出A跟B结合的位点
我在跟老板沟通，希望能够做这个试验
DLS倒是没有想过，我会考虑！
另外这个蛋白我是做过SAXS的
但是被称为“一点feature都没有！”
“完全没有折叠！”
“为什么非要研究这个蛋白！”
。。。。。
这样。。。。。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 48 这个你误会我的意思了。我的意思是，凡是要加cycloheximide 的实验，都不应该在当
时换液，和是否有control 无关。因为换上新的培养液的pH值，各种养分成分以及生长
因子的浓度都不一样，会刺激细胞大量制造蛋白的。但是因为cycloheximide 生效需要
至少30分钟，所以在这段时间里面细胞里的蛋白会突然变高，然后一个小时之后才会在
cycloheximide的作用下重新变低。
所以正确做法是应该在前一天提前换好新的培养液，即使实在要当天换液的话也必须提
前3个小时以上。然后，加cycloheximide的时候应该直接加到现有的培养液里去。但是
如果细胞不是养在平底皿里或者因为其他原因如果怕掌握不好的话，可以把原有的细胞
液吸出一半来，在外面把药品加了，然后再转移回去。
如果实在是没有办法，一定要加新培养液的话，那么在我的经验里，只要不超过20%的
体积，作出来的结果还是可以容忍的。
这个事情其实大部分不专业做降解的实验室都不知道，即使是有些做蛋白降解的实验室
，如果他们的老板不注意培训学生的话也不一定会知道这个事情。 |
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b****r
发帖数: 17995 | 49 被KO的调节蛋白可能正好抑制 可以降解你蛋白的蛋白，负负得正 |
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s******y
发帖数: 28562 | 50 不同的primer 之间不能直接比较的。
而且，RNA 的量和蛋白的量不是一回事。有些蛋白RNA虽然多，但是蛋白降解得快，正
常情况下含量也不高 |
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