s*********r
发帖数: 60 | 1 牛人都睡觉去了,偶来瞎说两句 :)
饮食偶不懂,就说说你的练习时间,2小时太长了吧,60分钟左右比较合适.
1.看看能否减少rep之间的休息时间,如从1min--30sec,这样对同一块肌肉的刺激也会强
一些.
2.如果时间长是由于要做很多动作,可以考虑每次练力量不必照顾到每一块肌肉,重点选
择几块练也行,这样效果可能会更好
3.蛋白吃得可真够多的,牛人来说说在锻炼当天吃多少合适吧?我觉得早餐或午餐有条件
也吃些水果和蔬菜,忘了在哪里看到了蛋白吃多了,蔬菜水果也要响应多吃,有助于蛋白的代谢
从书上看了一个关于reps的guideline,share一下
High intensity: 6-12 reps. Higher-intensity training poses a greater risk
of injury. This approach to training is suitable for athletes and
experienced exercisers.
Moderate intensity: 8-12 reps. This is the ideal number |
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n**e
发帖数: 2026 | 2 我的文章没有说“马吃草就能获得足够的蛋白质，不等于人吃草也能获得足够的蛋白质
。”也没有这个意思。
第一段：“素食提供的营养能够满足人类活动的需要。这已经是营养学界在素食的问题
上的共识。”共识就是不需要再证实：人吃素也能获得足够的蛋白质。问题：素食中的
蛋白能满足人类活动到什么程度。
第二段：马从植物中获得的蛋白能即可满足一般需要也可以满足比赛需要。
第三段：以本人的经验人从蛋奶素中获得的蛋白除了能满足人的日常生活，还可以满足
健身体育锻炼增长肌肉的需要。（不知道能否满足竞技比赛的需要。）
这三段中除第一段有一个问题外，其他都是事实。 |
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n**e
发帖数: 2026 | 3 你在使用双重标准。对你自己的观点，可以任意制造论据，比如人和马蛋白吸收率不可
比。当nile查到数据，你又说不是同一种食物。事实上它们都是植物蛋白。吸收率应该
大致相当。补充一点，刚刚知道的，马不能吃很多豆子，但吃玉米没问题所以用玉米计
算是比较实际而且科学的。
现在nile查到的数据已经有了。如果你要坚持你的观点。应该用确实数据证明你所谓马
吸收植物蛋白的能力远远高于人。我等着看你的数据。没有数据，其他都是废话。 |
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n**e
发帖数: 2026 | 4 要求nile吃素不能吃豆类，你就是在蛮横无理了。豆类是素食者最重要的蛋白来源。你
有什么理由要求素食者不吃豆类食品呢。你要证明素食蛋白不足也不应该要求素食者不
能吃豆制品吧。这种低级手法还是收起来吧。
蛋奶和豆不是一类的。我已经告诉你我吃的量很少，你坚持说吃了就不一样，我也不打
算与你争论。但是神经正常的人都知道，每天吃一个蛋与每周吃一个是大不一样的。
究其实质，你一直在回避定量问题。而是用查无实据的词语夸大人与动物吸收植物蛋白
的区别。 |
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n****s
发帖数: 137 | 5 看到版上有人讨论补充蛋白， 为什么要补充蛋白 ？
如果不是为了刻意长肌肉 ？不准备锻炼腹肌， 6packs ?
是否就不需要刻意补充蛋白 ？ |
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t*********t
发帖数: 4766 | 6 吃蛋白就可以。只不过有些专门运动后吃的蛋白补品吸收更快。不一定非要吃。喝没有
添加蛋白的牛奶也行
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.2.2 |
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x*******o
发帖数: 84 | 7 请JMS推荐 日常吃的胶原蛋白，还有维生素，类似一粒维生素就解决的那种。
之前从来都没想过自己吃胶原蛋白，现在27岁，觉得皮肤完全没有以前有弹性了，早晨
起来，脸肉嘟嘟的，脸色也很好，下午就完了，眼袋什么都出来了，很恐怖的。
不知道是不是需要开始吃胶原蛋白一类的东西了吗？
给妈妈买过明治， 不过觉得自己人在美国，就在周围买方便些， 请JMs 推荐。 |
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T***i
发帖数: 1354 | 8 趁着这几天放假，去理了理头发。在YELP上找了个好评如潮，离家又近的沙龙。
和stylist说修个刘海好了，再做个简单的regular perm,没想到这个理发师她人很好，
十分热心，和偶说，传统的负离子拉直太假不推荐，我所说的简单拉直RELAXIN是化学
药剂，价格虽然便宜，也可以拉直但是不滑不亮，而且蛮伤头发的。最后她建议我做角
蛋白拉直，原理就是把头发表面裹层膜，再STRAINGHT,那样看起来很自然，且持续三四
个月，也是目前最不伤头发的拉直。
后来我就做了她所说的那个Keretin拉直，没想到做完以后效果很好，整体发量看上去
没有减少，不会像负离子那样贴着脸，有些呆。Keretin做完后发丝是根根分明的，有
一种很飘逸的效果。
和传统拉直一样，做完这个两天不要洗头，不要绑发带。
在网上看到一些关于巴西角蛋白直发的讨论，果然评价不错，据说无甲醛。而且国内做
一次是2000到3000左右，偶找的这家沙龙是200，算起来还便宜了。
http://tieba.baidu.com/f?kz=591126639
另外，住LA的同学可以试试这家沙龙，stylist推荐Demi,非常耐心，有... 阅读全帖 |
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s**********8
发帖数: 1721 | 9 10.想问下，一个人每天可摄取多克的胶原蛋白粉。最低多少？（要保证效果呀），
最高又是多少？（要不吃出毛病来就麻烦）
这不正巧有人问到这个问题了，首先小分子胶原蛋白粉他是小分子蛋白质，
他不是药，一天服用个一克两克，综合考虑到纯度、吸收等因素，效果是有限的。我们
一般建议服用最低服用5克小分子胶原蛋白（平均分子量为1000D），最高10克。
只要是品质过硬的产品，就不会存在吃出麻烦来的问题，除非您一天吃上百
克，呵呵，怎么说呢，这就是服用蛋白质，就像您吃鸡蛋一个道理。
好多朋友服用胶原蛋白的过程中，出现了这样那样的副作用，有的还挺严重
，这个问题请参阅1.胶原蛋白产品是否安全？是否会引发小叶增生？是否含有激素？ |
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f**********r
发帖数: 18251 | 10 【 以下文字转载自 Military 讨论区 】
发信人: sautin (老将萨乌丁), 信区: Military
标 题: 震惊世界：海归院士施一公首揭老年痴呆症致病蛋白结构(图)
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Jul 4 12:33:21 2014, 美东)
施一公在发布会现场
今天上午，记者从清华大学获悉，著名结构生物学家、中科院院士、清华大学教授施一
公研究组在世界上首次揭示了阿尔茨海默症（俗称老年痴呆症）发病直接相关的人源γ
分泌酶复合物的精细三维结构，为理解γ分泌酶复合物的工作机制及阿尔茨海默症的发
病机理提供了重要线索。该成果于6月29日在英国《自然》杂志在线发表。
成果发布
"这是我职业生涯上，最重要的突破"
今天上午，在清华大学召开的发布会上，施一公教授展示了阿尔茨海默症发病直接相关
的人源γ分泌酶复合物的精细三维结构。
他在介绍他的研究组成果时表示，此前的研究表明，阿尔茨海默症的发生和大脑中淀粉
样斑块的形成密切相关。淀粉样斑块是由膜整合蛋白酶复合物γ分泌复合酶异常切割"
淀粉样前体蛋白"APP而产生过量易聚集的Aβ42肽所致。
γ分泌酶复合物可以理... 阅读全帖 |
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l*****o
发帖数: 26631 | 11 上次艾迪不是查出来lyme positive么， 然后做了血检和尿检。 结果是血检正常， 尿
检有一项蛋白的指标偏高， 其它的都正常。 vet说有可能是因为我喂raw， 饮食高蛋
白的结果。 说可以再做一个尿蛋白专项的检测。
我不太明白， 首先是不知道吃raw是不是会影响尿检的结果， 其次是不知道需不需要
做那个专门查尿蛋白的测试。
请问有没有人懂啊。。。？ |
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o*****s
发帖数: 1445 | 12 不知道呀。可能全力献身科学了。那地方工作很吓人的。基本是一天１２小时，都住宿
在单位对面的。我都是明码跟他联系的。我有他电话，EMAIL，和实验室电话的。当然
了，都是我周围的女生贡献的。哎，可惜那兄弟再也不理我了。
蛋白啊，现在我们这一届，就看你能在学术上走到哪一步了。以前我跟大家说了，华东
理工啊，不要说去比交大了。就是华东师范都比不过。人家在NYU化学系是有正教授的
。我们也就在GATECH的化工系有教授。我们这一届都完蛋了。就看蛋白能走多远了。
蛋白他献身科学不是一天２天了。他刚来美国没几年就发了医学的文献。现在都有上百
的引用了。
他对于科学的献身，应该受到我们这一届的每一个华理人的尊敬。 |
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p*****n
发帖数: 981 | 13 ☆─────────────────────────────────────☆
stlstl (射天狼) 于 (Thu Jan 18 18:02:36 2007) 提到:
有什么方便快捷的方法把几个已知的蛋白的上游基因组序列拿出来？
这些蛋白是有NCBI ID的。UCSC genome 倒是能找到一些，但是有些非模型物种的蛋白
就找不到了。
☆─────────────────────────────────────☆
puppeteer (减肥中的河马) 于 (Thu Jan 18 19:37:47 2007) 提到:
Chromosome walking?
☆─────────────────────────────────────☆
stlstl (射天狼) 于 (Thu Jan 18 21:59:44 2007) 提到:
sorry, i mean electronically to find the sequence. any idea? Thanks.
☆─────────────────────────────────────☆
BM |
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p*****n
发帖数: 981 | 14 ☆─────────────────────────────────────☆
giantbird05 (大鸟) 于 (Thu Jan 25 20:19:46 2007) 提到:
要裂解几十个T75 FLASK的细胞，然后用抗体把裂解液中的蛋白拉下来。。
裂解液的要几十毫升，我想浓缩一下，但是怕变性影响以后的免疫沉淀。
高手请进，帮我指导一下。
多谢了。
☆─────────────────────────────────────☆
pigskin (六如) 于 (Thu Jan 25 20:23:50 2007) 提到:
裂解液中的蛋白浓度已经很高了。。。
不好浓缩，而且容易把目标蛋白搞死。
☆─────────────────────────────────────☆
KingofMS (offer来了，H-1B没了。我苦) 于 (Thu Jan 25 20:24:05 2007) 提到:
columns packed with C4 (based on hydrophobicity)?
☆────────────────────────────── |
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a********e
发帖数: 3771 | 15 最近一次做western，用NEPER kit提取胞浆里的ERK和p38蛋白。因为用划伤组织做刺激
，脱落不少细胞，我就把medium离心得到这些脱落的细胞。同时在培养皿里加冰PBS，
在冰PBS里刮下剩余的细胞放进脱落的细胞里再次离心。然后用kit里CER lysis buffer
裂解（已加入inhibitor cocktail）。
裂解的时候我vortex两次，每次15sec。NEPER protocol要求vortext一次，15sec即可。
结果照片洗出来什么都没有，连EGF刺激的positive control都没出来。
以前只用过一次NEPER，erk出来band，而且结果可信。不同点在于没有收集脱落的细胞。另外，这次实验煮沸变性的时间长了，用了15min。
所以我考虑是不是多次离心、vortex是蛋白降解，也可能是收集脱落细胞的时候medium
和细胞都没有冷却到ice cold，磷酸酶还在起作用。煮沸时间长我不确定会不会对实验有影响。
另外，p38一直没做出来过。用超声裂解细胞也好，用NEPER vortex裂解也好都没出过
band。
请高手指点，同行探讨。谢谢。 |
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l******e
发帖数: 14 | 16 困扰很久了，请教大家：
两个蛋白，一大一小，如果大的紧紧抓住小的的，在正常的SDS胶上无法分开，那么其
显示的条带大小是相当于两个蛋白相加还是和比大蛋白略小（小的拽着大的往前跑）呢
？ |
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a********x
发帖数: 94 | 17 很多人做过了。
我只是要知道那个蛋白（一种酶）在不同细胞里面的含量， 所以要重复别人的试验，
我暂时想用不同的方法去得到结果，2d使我想用的一种，很多人做过了。
我是新手，连strip还没买，现在系里面有一个bio-rad protean ief cell。
抽提蛋白？2d gel不是把蛋白都弄成一个点阵图然后digestion么？？
谢谢指教。 |
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v*********i
发帖数: 40 | 18 全细胞蛋白做WB。
以前我是这样做的：
转染之后，6 cm 板（5×10^6)直接拿200 ul PBS冲下来，加过量的5 × SDS PAGE
loading buffer （我一般加80 ul），95度煮30 min；然后 13000 rpm 离心 10 min。
基本看不到沉淀。
然后取10 ul 跑胶WB；因为转染起始细胞数目一样，所以基本不调平，看到的beta-
actin就是平的。
现在的老板说我这样做不对，因为没有测蛋白浓度。他要看到我把每个样品的浓度都写
到本子上；还说直接煮不能溶解全部的蛋白（FT）。他很固执，我只好按他的做：
转染之后，6 cm 板用RIPA buffer 800 ul, 加那个Roche Cocktail蛋白酶抑制剂， 冰
上放30 min，然后 13000 rpm 离心 10 min，结果看到大量沉淀。我感觉沉淀跟直接低
速离心收细胞的沉淀差不多。是不是细胞都没破裂啊?
哎，连个成熟的protocol都木有……
谁能给我个完整成熟可靠的呀?说的详细点。
谢谢。
p.s.
我不放心，现在把那个裂解液又拿去超声了；可是超声仪太古老，上面没有能量显示… |
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D****s
发帖数: 5 | 19 要表达一个全长40KD的蛋白，用的是pET32a+ vector. 转化入BL21(DE3) bacteria.
Western 显示full-length protein只有大约10%， 主要被降解成2条非常强的band.
而只表达这个蛋白的fragment（大约一半，20KD), 就没有蛋白降解的发生。
请问有什么好的建议？谢谢 |
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D****s
发帖数: 5 | 20 此蛋白是一个ubiquitin E3 ligase. 加了蛋白酶抑制剂并且是低温操作，还是绝大部
分蛋白被降解。感觉降解应该发生在收菌以前。我需要表达纯化全长的此蛋白。
请问这种情况，换一个E.coli host strain 来表达会有效果吗？ |
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b******n
发帖数: 4225 | 21 你试过低温表达了吗？比如说30度或者25度
温度低可能蛋白降解会慢一点
另外表达的时候可以尝试加3%左右的乙醇看看效果
你是不是纯化之后过柱再做的western？
如果没问题，能否将序列和western电泳图（最好有marker）发给我看看
s****[email protected]
反正蛋白纯化是门艺术，不同蛋白纯化方法不同
多试试看运气吧 |
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s****l
发帖数: 395 | 22 这问题太tricky了,我以前都load好多(20ug),可以看到很多杂拌,但是主band太明显了(
已经饱和了),结果被committee批评说提蛋白水平太差,蛋白太不纯.
结果我就老实了,按照paper上别人load的强度,同样的sample,我load 1ug后就剩下1条
主band,然后大家都很开心的说蛋白很纯一条带. 所以我觉得最好做个梯度, 从0.5ug到
20ug, 自己清楚一个purity,给别人show另一个purity.
ug |
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j*********n
发帖数: 168 | 23 如果对蛋白的纯度还没准确测量，那就分别上5、10、15（加了loading buffer）后的
，大致估一下，下次照此办理……
细胞裂解的上清，杂蛋白比较多，可以稍微少上点样；经过凝胶柱或者离子交换提纯的
，要少上些……
跟做菜一样，放多少盐，你自己嘴巴尝尝就有数了……
当然，你得先会做菜。
你问的好几个蛋白分离，检查的问题都很入门啊，不是入错了行吧…… |
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W*********e
发帖数: 247 | 24 不是你蛋白的降解产物? 另外镍柱的特异性不好, 能拖下来很多杂蛋白
道lysozyme没被洗掉吗？按理lysozyme不应该结合Ni柱啊，难道lysozyme粘住我要的蛋白 |
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e****s
发帖数: 1125 | 25 这个只能说教训啊!!!不保存菌株！
另外，有没有比较Sup和inclusion body里面的蛋白量？
是不是可溶蛋白太少了，需要优化诱导条件。
长菌和诱导条件每次都严格一样吗？ |
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T**********t
发帖数: 1604 | 26 我有几个mutate过的小蛋白，7k左右的分子量。在e.coli里表达的。site directed
mutagenesis之后质粒测序都是对的。表达出来的蛋白用质谱检测分子量，大部分都是
准的，但是有少数几个的测量分子量和计算分子量出现误差，分别差14，74和113。都
是测量分子量比计算分子量低。蛋白纯度很好，SDS-PAGE只有一个条带，质谱上也只有
一个主峰。请问这个误差可能是由于什么造成的呢？ |
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g*****3
发帖数: 107 | 27 最近在提纯一个GST-tag的蛋白，蛋白表达在pellet需要denature condition提纯， 纯
化后需要做活性检测。怎样才能让蛋白的活性在提纯过程中不丢失呢，需要用
refolding kit吗？谢谢 |
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s******y
发帖数: 28562 | 28 这个就是这样的，你要想漏过去的反而漏不过去。
不想要漏过去的反而会哗哗的漏掉。
而且，这种concentrator 设计的时候不是为了分离蛋白用的，
像你这种用法，会让很多蛋白会卡在孔里或者粘在膜上，不可能全部漏过去的，
能弄到20%已经不错了，但是如果你测一下上方溶液里的蛋白含量，应该会小于80% |
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S*****s
发帖数: 287 | 29 我用的老鼠大脑是以前取下来 fresh frozen 的。这样的脑子既可以用来切片也可以用
来提蛋白或者 RNA。如果你有新鲜的大脑效果应该更好。如果你只是用来提蛋白可以把
冻好的脑组织放在加了 protease inhibitor 的 RIPA 里面解冻，然后在 RIPA 里面
homogenize。你说的那个加液氮粉碎组织的我也做过，不过是把组织粉碎之后提 RNA
用的，那个还要用专门的冷冻好的 mortar pestal，蛋白不需要这么苛刻的条件。 |
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t*d
发帖数: 1290 | 30 EGFR 是如雷贯耳。不过不知道是这么重要的药物靶点。多谢！
去google了一下，EGFR 是个膜蛋白，在很多癌细胞中高表达。大部分 EGFR 的
inhibitors 直接就抑制癌细胞的生长了。我的一个想法是，利用癌细胞特异表达的膜
蛋白来帮助给药。EGFR 之类的蛋白当然是个很好的目标，也确实有人利用它设计给药
系统。不过如果我们只把条件定为在癌细胞膜特异表达（但不一定和癌细胞的生长直接
相关），应该可以找到更多的潜在靶点。这些靶点可以不是药物的直接target，但是可
以帮助设计更好的给药系统，比如 Mark Davis 的nanoparticle。
我想建一个癌细胞膜表面特异表达的数据库。也许能混一篇文章在NAR的database 专刊。 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 31 刚从一个会议回来
有个talk就像放了一颗卫星一样引起大家广泛关注和讨论
不知道版上有没有讨论过
写下来和大家分享哈
就是斯坦福搞了个超级强大的Free Electron Laser
"ultra fast",大概3-60 fs
"extreme high intensity"，差不多是目前第三代Synchrotron的10^12倍(十的十二次方)
Linear的，占地小
最神奇的是Arizona State一个组用这个超级高能的Laser做蛋白结晶的衍射
不仅能收集到衍射pattern
而且居然没有 crystal damage
最最神奇的是，不需要大的蛋白晶体了
都用的nm scale的，大概只有几百个分子的，肉眼看不到的晶体
全部全自动，用auto sampler上样
不需要在cryo-protect，不要mount，不用rotate。。。。
甚至可以遥控的搜集数据
但是数据量非常之大，大到必须要考到硬盘上寄走，无法直接联网下载
talk之后传统搞结构的纷纷喜忧参半
因为大概十年内大家都会开始用这种方法得到蛋白结晶的衍射数据
不用再长很大的晶体会使解构容易不止十倍
以前学的各种t |
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C*******e
发帖数: 4348 | 32 是啊，其实这个Free Electron Laser在2006年就建了
我一会儿贴个图上去，是第一个用FEL衍射然后“解构”的一张图片，是发表在2006年
的Nature
Physics上的
给talk的那个组就要发Science文章了，他们是第一个用这个FEL搞蛋白结构的
一开始没有任何一个组织愿意给他们资助
因为没有人相信这么大的能量下蛋白不会被摧毁，
没有人能相信他们能拿到衍射数据
现在嘛，$$$$滚滚而来啊～
而且可以说是将会彻底改变蛋白结晶的现状 |
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s******y
发帖数: 28562 | 33 动态光散射？ light scattering? 那个不适合用来检测那么小的蛋白的啊！
难道你们附近实验室都没有UV spectrometry?
另外，回答你刚才另外一个问题： 如果用G-150, 那么aggregate/polymer
会随着溶液直接往下走，也就是不进入resin 内部，所以会先出来。
单个蛋白会进入resin内部，所以会出来比较慢。
但是，在上柱子之前，最好先用0.2um nitrocellular membrane filter 过滤
一下样品，否则大块的沉淀会堵住resin.
另外，柱子很贵的！便宜的也得几百，贵的上千。
我建议你要是有可能的话，找别人帮你做。 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 34 理论上你可以这么干，不过没有FPLC土法上马的话，做起来很事倍功半。而且我没用过
动态光散射做检测器，不知道它的灵敏度够不够。也就是说如果蛋白浓度低的话，它能
不能测出来。紫外吸收的灵敏度是很高的。或者像前面有人说的，每个fraction都跑胶
看一下，就知道哪个有蛋白了。但是样品管多的话很麻烦。 |
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m*********s
发帖数: 1188 | 35 这个检测是可以的, 只是蛋白浓度不能太低, ug/mL以上吧..低了看不出来.. 检测个
30k以上的蛋白是可行的..象BSA的话很容易测出来..动态光散射...
关于贵的问题, 我想我买柱子自己灌行不? 我的样品少, 一次不到0.1mg...柱子有个
10cm长足够了, 就让溶液靠重力慢慢流好了, 费个半小时也就搞定....不过这样的话,
装柱子的管子该去哪里买呢? 不知道那玩意叫啥名字.... |
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m**z
发帖数: 787 | 36 Light scattering should work as well. It is just not a common method for
protein detection after chromatography.....
这个检测是可以的, 只是蛋白浓度不能太低, ug/mL以上吧..低了看不出来.. 检测个
30k以上的蛋白是可行的..象BSA的话很容易测出来..动态光散射...
关于贵的问题, 我想我买柱子自己灌行不? 我的样品少, 一次不到0.1mg...柱子有个
10cm长足够了, 就让溶液靠重力慢慢流好了, 费个半小时也就搞定....不过这样的话,
装柱子的管子该去哪里买呢? 不知道那玩意叫啥名字.... |
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C*******e
发帖数: 4348 | 37 谢谢sunnyday，还特意去帮我查了产品
怎么说呢，这种centrifugal filter unit我很怀疑会很快就堵住了
尤其像lysate这种蛋白浓度很高的东西
我就是想知道有没有办法粗分一下
事实是这样的，GST-tag表达蛋白以后有一多半都是GST（25 kDa）
比较少的部分是GST-fusion protein （50 kDa）
纯化的时候GST绑在柱子上
得到的目的蛋白只有一点点（1 liter culture得到300 ul * 1 mg/ml）
这个好像是个常见问题
好像有的可以通过额外连一段linker来解决
我就是想在不重新做construct的情况下
如果有办法可以一开始粗分一下，然后再上柱子，就方便多了
所以想的是有没有什么原始的生化方法可以粗分的 |
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s******r
发帖数: 2876 | 38 能不能用硫酸铵沉淀？
重做constructs显然要容易得多。
谢谢sunnyday，还特意去帮我查了产品
怎么说呢，这种centrifugal filter unit我很怀疑会很快就堵住了
尤其像lysate这种蛋白浓度很高的东西
我就是想知道有没有办法粗分一下
事实是这样的，GST-tag表达蛋白以后有一多半都是GST（25 kDa）
比较少的部分是GST-fusion protein （50 kDa）
纯化的时候GST绑在柱子上
得到的目的蛋白只有一点点（1 liter culture得到300 ul * 1 mg/ml）
这个好像是个常见问题
好像有的可以通过额外连一段linker来解决
我就是想在不重新做construct的情况下
如果有办法可以一开始粗分一下，然后再上柱子，就方便多了
所以想的是有没有什么原始的生化方法可以粗分的 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 39 谢谢
我现在的问题不是elute以后怎么分开两个蛋白
因为我们用PreScission Protease
我想的是最好能提高resin的利用率
现在连在resin上的大多是GST tag alone
严重影响了纯化蛋白的产率
而后续研究又要用大量的蛋白
而且最好是同一batch提的
现在想到也许可行的是ammonium sulfate ppt
the
seperate |
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A*******e
发帖数: 284 | 40 诸位达人们，困扰我的问题请教。构建GFP融合蛋白，GFP放在C段，GFP的ATG需要除掉
吗？不除掉的话细胞会不会把GFP前面我的基因当作5'utr 而只翻译free GFP出来吗？
一个lab mate构建GFP融合蛋白，GFP放在C段，WESTERN检测发现既有融合蛋白也有free
GFP,这如何解释？ |
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C*******e
发帖数: 4348 | 41 你这样问是没有人能够明白你想问什么的
分离蛋白用的柱子多了去了
原理不一样柱子也不一样
你至少要再多一些信息才行
比如这个柱子是根据蛋白的什么性质“挂”蛋白的 |
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s********g
发帖数: 91 | 42 现在需要一种酶水解蛋白成氨基酸，老板让试pronase E， 作了一次，LC—MS，啥峰也
没找到。我是按照trypsin的protocol 做的，是不是不能用trypsin的方法呀？
我对蛋白这一块一点都不懂，瞎折腾了很久，一点结果都没有。请问哪位大侠做过蛋白
彻底水解的，请给点建议，如果你有好的protocol， 可不可以发给我一份，小女子在
此不胜感激。
多谢。 |
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s******e
发帖数: 1073 | 43 大肠杆菌表达异体蛋白，想知道蛋白是否可能被磷酸化修饰？谢谢！ |
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s******e
发帖数: 1073 | 44 一般磷酸化会影响蛋白的电泳结果吗？我的蛋白电泳条带有些模糊。分子量大约为 21
KD.Thanks a lot! |
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s******e
发帖数: 1073 | 45 I got the following from the web, does these mean no specific
phosphorylation or no phosphorylation at all?
"在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵
体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。" |
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m******5
发帖数: 1383 | 46 小弟刚从生化转到发育领域玩
目前正在做一个Homeodomain protein,查10年来的相关的发育领域的文献（DB,
development）非常奇怪地发现都只有in situ 检测蛋白表达和分布，没有免疫组化，
也没有western
我试了市面上所有commercial抗体，也都不能在组织里检测到（western 和免疫组化）
作为阳性对照，转293 overexpress的蛋白检测起来都是没问题的
PS ：我做组织裂解液是用RIPA+超声打散的办法（组织在RIPA buffer里沉淀后直接用
超声打匀，反复三次），理论上也应该没问题？
求指教！
另外还有一个好奇的地方：很多做发育的文章也都只用ｉｎ ｓｉｔｕ来说明问题，这
是什么原因呢？ 是因为组织里免疫检测不到很正常？
另外，没有蛋白水平的检测能说明问题么？ 比如可能蛋白质已经被truncate 了 ，或
者蛋白质aggregate了 ，或者被调控降解了 ，这些都是不能用简单的insitu来证明的
吧？ |
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b********c
发帖数: 161 | 47 invitrogen pEXP5-NT/TOPO vector 和 BL21(DE3)Star competent cell
细胞长到 OD600=0.6~0.8时加入IPTG (final C=0.5mM)诱导表达, 25C和37C都试过,时
间点为2h, 4h 和6h. 然后提纯蛋白和跑SDS-PAGE：诱导前，诱导后，提纯后.
由于T7的leaky expression,我仍然提纯到了我需要的蛋白,关键问题是蛋白的量在IPTG
诱导前和诱导后没有变化。请问到底是哪个环节出错了呢？ |
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e****s
发帖数: 1125 | 48 我一般在提一个新蛋白以前，先把温度和IPTG条件做个Expression test。
蛋白量上去了，后面就好办了。
IPTG条件多变几个，我手头的蛋白有10umol诱导的，有3-5mM诱导的，条件差别很大。
IPTG |
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s********n
发帖数: 2939 | 49 一般来说加了IPTG对蛋白的表达会有明显影响的，如果可溶部分不变的话，很可能都跑
到inclusion body去了。
不过优化蛋白表达是很费劳力的活，如果你的实验对蛋白量要求不大的话，leaky
expression也能凑活着用。 |
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s********n
发帖数: 2939 | 50 就像楼上所说，可能是GST增加了你的蛋白的溶解度，而在pEXP5表达载体上表达的可能
是misfolded，然后被host降解了，所以没有看到inclusion body。
还是那句话，如果你需要的蛋白量不大(100-500 ug)，用leaky expression也许就够用
了，或者用GST载体表达，然后用protease切掉GST Tag。如果你需要的量比较大（>1
mg），你可能就需要做一些蛋白表达条件的优化，比如temperature, host, inducer
concentration, chaperones, tags etc.。 |
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