t*******o
发帖数: 516 | 1 有种可能是，你的fusion protein在低盐的情况下溶解度很好，但蛋白本身需要高盐，
所以TEV切了后蛋白沉淀。如果是这样的话，可以在加TEV后若干时间，比如4C, 三小时
，在蛋白还没沉淀前，dialysis到高盐里。我以前一个蛋白就是这么纯化出来的。 |
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j*******8
发帖数: 933 | 2 又上来问问题了。
事情是这样的： 昨天用干冰冷却的丙酮来沉淀蛋白， 当即就看见了白色絮状沉淀。
然后将试管转移至-20度过夜。 可是今天早上来看沉淀反而消失了！ 请问是什么原因
？ 怎么补救？ 谢谢！ |
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g*****y
发帖数: 6325 | 3 我纯化的蛋白在dialysis过程中总是有很多沉淀。 纯化的蛋白要做NMR所以好多方法都
不可行。 因为用ion exchange
chromatography, 也不能用高浓度的Nacl. 大家有没有什么建议呢？ |
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v**********t
发帖数: 9 | 4 从Dharmacon订的RNA，25mer, single-strand, HPLC purified, deprotected,
desalted.
拿到手后用DEPC water resuspend, 加到蛋白溶液后就把蛋白给沉淀了。先后订的三
批RNA全这样。
哪位知道这是怎么回事？ |
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M*******C
发帖数: 183 | 5 我看了一下网站，兼容的试剂名单里没有SDS，你用它来做SDS的样品好用吗？
你说的蛋白沉淀下来再测是什么意思？就是裂解-离心-取上清？
比如我的细胞，我加了含SDS的去裂解，为了核蛋白，这样lysate很粘，我就去超声，
等离心后经常看不见沉淀，直接就拿去用了。
The RC DC protein assay is compatible with the following reagents and
buffers in addition to those compatible with the DC protein assay:
CHAPS 2% ReadyPrep sequential extraction reagents 2 and 3
DTT, 350 mM Sodium hydroxide, 2.5 M
EDTA, 0.1 M TBP, 2 mM
Imidazole, 0.5 M Tris, pH 8.4, 0.5 M
Laemmli buffer with 5% β-mercaptoethanol ... 阅读全帖 |
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k******0
发帖数: 1073 | 6 蛋白质本来就是在室温以上温度工作的。条件合适的话，挺稳定的。没有污染蛋白酶，
就不会降解。有些蛋白沉淀，酶失活，很可能保存的条件不够好或蛋白本身不稳定。
反复冷冻解冻反而不好。 |
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s***m
发帖数: 6197 | 7 对 的确是 还是要看最后蛋白的用途了
我们以前直接就是直接把蛋白沉淀了
不会太麻烦的 |
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j*******8
发帖数: 933 | 8 老大所言极是！可惜昨天没看到回帖， 我们就直接离心了， 结果拿到写浅黄色沉淀。 |
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p*******i
发帖数: 449 | 9 用分子筛柱脱盐 没必要透析那么复杂 用低盐缓冲液走一遍分子筛应该就差不多了
猜测你的蛋白用尿素之类的缓冲液做的纯化 所以关键不是用什么脱盐 是你的蛋白质由于
疏水性的问题必然不能达到你要的盐浓度
如果后续检测不影响的话 可以考虑用DMSO促溶
仅仅是点建议 以前做蛋白质的功夫快忘没了 |
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j******3
发帖数: 5244 | 10 直接上wb肯定是不行的
我现在做了下预试验，从200ul里面用TCA把蛋白沉淀下来
然后全load到page gel里，这样wb是可以比较容易检测到的
我现在的想法是能不能找个啥软件，能够根据WB条带的浓度来进行个初略的定量
我知道这样不准，但是想先试试
不知道有没有这样的软件 |
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s******y
发帖数: 28562 | 11 啊？那这个kit岂不是耍赖皮么？都把蛋白沉淀了重新溶解，那还算什么
sds-compatible？ |
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a******g
发帖数: 71 | 12 endostatin的refolding是一件极其困难的事情，Folkman最早的paper里他们提到有99%
的蛋白沉淀而无法复性，所以罗的工艺在此处有独到之处。
罗的工艺基本是遵循纯化，复性，再纯化（不依赖Ni柱）的途径，最后产品纯度高当然
不只是蛋白质，并且元素检验也没有Ni残留，至于你说的endotoxin更是检测不出。
如果你不了解具体的过程，就不要着急trivialize别人的东西。 |
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s******s
发帖数: 13035 | 13 蛋白沉淀下来再测就行了。biorad RC-DC |
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a*****n
发帖数: 2835 | 14 蛋白沉淀最后应该在管底，用loading buffer溶解煮了上样
endosome
endosome
SDS- |
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g*********d
发帖数: 233 | 15 目前表观遗传学(Epigenetics)通常被定义为基因表达通过有丝分裂或减数分裂发生了
可遗传的改变, 而DNA 序列不发生改变[1, 2]。表观遗传学的机
制主要包括DNA 甲基化、组蛋白修饰及非编码RNA。DNA 甲基化(DNA methylation)是指
在DNA甲基转移酶(DNA-methyltransferases, DNMTs)的催化下, CpG 二核苷酸中的胞嘧
啶被选择性地添加甲基, 形成5-甲基胞嘧啶[3, 4]。DNA 甲基转移酶有两种, 其中
DNMT1 主要起维持甲基化的作用, 能使半甲基化的DNA 双链分子上与甲基胞嘧啶相对应
的胞嘧啶甲基化, 可参与DNA 复制双链中新合成链的甲基化[5]; 而DNMT3a 和DNMT3b
主要起形成甲基化的作用, 能在未发生甲基化的DNA 双链上进
行甲基化[6]。DNA 甲基化一般与基因的沉默相关,DNA 去甲基化则与基因的活化相关[7
~9]。
组蛋白修饰(Histone modifications) 是指组蛋白的基础氨基末端尾部突出于核小体,
常在转录后发生变化, 包括甲基化、乙酰化、磷酸化和泛素化等翻译后的修饰... 阅读全帖 |
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s******y
发帖数: 28562 | 16 裂解的时候，先把细胞用dPBS洗一洗
既然你要跑总蛋白的胶，那何必用TCA沉淀呢？直接用8M Urea 裂解然后
直接上胶不更好么？这样还省得你操心phosphotase 的问题。
另外，如果你自己没有做过trpsin digestion, 不如让跑质谱的人帮你做算了。
他们一般都负责这一步的。你要自己做，万一没弄好还更麻烦。
最近要做一个质谱实验，目的是检测一个信号转导通路上的蛋白被抑制剂抑制（没有抑
制的作为对照组），病原体感染后某个器官的蛋白水平变化, 当然很希望能够看到磷酸
化蛋白的变化。
这个器官是单层细胞的，几个平方毫米大小（取50个左右的个体作为一个样品）；
我的初步实验步骤是：器官细胞在裂解液中裂解---沉淀蛋白--凝胶电泳蛋白---胶上用
胰蛋白酶分解蛋白并收集--MS 分析。
请教做过的朋友：
1）用什么溶液和方法来进行器官细胞裂解能够充分裂解细胞，又能够不影响后面的质
谱分析？
2）在裂解完细胞后，用氯仿甲醇沉淀的方法纯化蛋白两次，并除去裂解液中一些盐和
去垢剂；请问这步操作会不会造成蛋白降解，尤其是磷酸化基团的去磷酸化？
2）质谱一般的上样量为多少？ 每个样品... 阅读全帖 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 17 1.这个蛋白超长的，100kDa左右，我们试过全长，试过分不同“domain”；加N-his，
加C-his，加N-GST，加Strep－tag。这些都试过。然后做过GST-Tag的pull down，有拉
下来B蛋白
不太明白你说的最好的办法试加TAG是针对什么方面说的？
可溶性？这个蛋白本身就挺可溶的，是加了B才会沉淀
正确折叠？这个蛋白应该属于 intrinsically unstructural的那一类
表达？蛋白表达也不错
2.这个还没有试过，flow through的buffer跟配好的同一批buffer有什么不同之处啊
3.谢谢建议！你是说用PEI先沉淀DNA／RNA，然后硫酸铵沉淀蛋白是这样么 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 18 非常感谢！你给的建议非常具体、可操作
不过我还是想问，你说的“先让你的蛋白不沉淀了再说”是指让A+B在一起不沉淀了再
说么？
因为A蛋白单独不沉淀啊，30mg/ml，我觉得这个数字来说的话怎么都不能算是不太可溶
的情况
那么MBP和NUSA提供的优势是什么呢？
A蛋白本身不是没有能正确折叠的问题
是intrinsically unstructured without it's binding/interaction partner
而这个partner是B
但是现在的测试条件下（不管是in vivo还是in vitro）可能A和B的selfassemble的条
件不对
直接变成了沉淀
LZ |
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g*******f
发帖数: 427 | 19 我想用一个蛋白的抗体来免疫沉淀这个蛋白，目的是要从组织中富集这个蛋白用来做质
谱看它的在体内的修饰情况。
我用抗体沉淀蛋白后，加dynabeads protein G,洗脱后跑western blot 看蛋白有没有
被沉淀下来。western blot用做IP的抗体检测，发现在55KDa有非常强的带，但是我的
目的蛋白是40KDa, 这个带应该不是protein G，因为protein G 只有17 kDa。 我想请
问这个带会是什么呢？用什么抗体做western blot 来检测这个ip 后的产物比较好？
多谢了 |
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v*********i
发帖数: 40 | 20 全细胞蛋白做WB。
以前我是这样做的：
转染之后，6 cm 板（5×10^6)直接拿200 ul PBS冲下来，加过量的5 × SDS PAGE
loading buffer （我一般加80 ul），95度煮30 min；然后 13000 rpm 离心 10 min。
基本看不到沉淀。
然后取10 ul 跑胶WB；因为转染起始细胞数目一样，所以基本不调平，看到的beta-
actin就是平的。
现在的老板说我这样做不对，因为没有测蛋白浓度。他要看到我把每个样品的浓度都写
到本子上；还说直接煮不能溶解全部的蛋白（FT）。他很固执，我只好按他的做：
转染之后，6 cm 板用RIPA buffer 800 ul, 加那个Roche Cocktail蛋白酶抑制剂， 冰
上放30 min，然后 13000 rpm 离心 10 min，结果看到大量沉淀。我感觉沉淀跟直接低
速离心收细胞的沉淀差不多。是不是细胞都没破裂啊?
哎，连个成熟的protocol都木有……
谁能给我个完整成熟可靠的呀?说的详细点。
谢谢。
p.s.
我不放心，现在把那个裂解液又拿去超声了；可是超声仪太古老，上面没有能量显示… |
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s*********t
发帖数: 600 | 21 你说的QC assay是什么？
我做western检测NE和CE的quality，总是发现CE里面也混有少量NE蛋白（anti Histone
），NE
里面混有少量CE （anti GAPDH）。不过这些都是粗蛋白总蛋白，怎么进一步检测呢？
我担心的一是破碎细胞之后的细胞核pellet已经像鼻涕了，是不是细胞核也被弄破了？
然后NE和CE各自有少量互相污染。
二是透析会产生大量沉淀，直接稀释也会产生很多沉淀。也许你要研究的未知蛋白就在
这些沉淀里面呢 。。。
我查了n多文献，从80年代的方法到现在的，都不相同。同一个实验室，不同人各自的
做法也有差异。
无所适从啊。 |
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W*********n
发帖数: 775 | 22 最近要做一个质谱实验，目的是检测一个信号转导通路上的蛋白被抑制剂抑制（没有抑
制的作为对照组），病原体感染后某个器官的蛋白水平变化, 当然很希望能够看到磷酸
化蛋白的变化。
这个器官是单层细胞的，几个平方毫米大小（取50个左右的个体作为一个样品）；
我的初步实验步骤是：器官细胞在裂解液中裂解---沉淀蛋白--凝胶电泳蛋白---胶上用
胰蛋白酶分解蛋白并收集--MS 分析。
请教做过的朋友：
1）用什么溶液和方法来进行器官细胞裂解能够充分裂解细胞，又能够不影响后面的质
谱分析？
2）在裂解完细胞后，用氯仿甲醇沉淀的方法纯化蛋白两次，并除去裂解液中一些盐和
去垢剂；请问这步操作会不会造成蛋白降解，尤其是磷酸化基团的去磷酸化？
2）质谱一般的上样量为多少？ 每个样品要多少ug, 才能够得到比较理想的检测结果？
20ug蛋白一般需要多少胰蛋白酶来降解？
3）大家一般会加入什么样的磷酸酶抑制剂来抑制磷酸化？
谢谢! |
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f***y
发帖数: 4447 | 23 兴趣，专注力，刻苦耐劳，来自大牛实验室是许多成功科学家的特征
在生命之海徜徉——记破解艾滋病病毒研究30年谜团的黄志伟教授
发布时间： 2014/1/9 10:51:30 被阅览数： 55 次 来源： 哈尔滨工业大学生命科学
与技术学院
哈工大报讯（闫明星/文 兰锐/图）2012年3月1日，他正式来校报到，从零开始建设实
验室；
2012年7月18日，他开始了在我校的第一个实验；
2013年6月14日，他于国际顶级杂志《科学》（Science）在线发表了与清华大学
柴继杰教授研究组等合作完成的研究论文；
2014年1月9日，他在国际顶级杂志《自然》（Nature）在线发表了《艾滋病病毒
Vif“劫持"人CBF-β和CUL5 E3 连接酶复合物的分子机制》的研究论文。该文章被选为
精选文章在同期《自然》杂志《新闻与视点》栏目中重点推荐。
短短一年多时间，他带领着新建团队第一次揭示了世界顶级结构生物学家们一直
以来梦寐以求的艾滋病病毒毒力因子（Vif）的结构，破解了困扰这一领域科学家们30
余年的谜团，并为理性设计靶向该复合物的全新艾滋病药... 阅读全帖 |
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z******i
发帖数: 120 | 24 楼主，你的这些TAG基本没什么用，除非你的蛋白非常小。能说一下你现在用的蛋白
DOMAIN多大吗。
GST 对小蛋白非常有用，但大点的就作用有限，有时候还有副作用（因为是DIMER有聚
集效应）。 由于是DOMAIN，很有可能暴露HYDROPHOBIC区域，造成AB蛋白假结合或者聚
集沉淀。但希望不是这样。既然有文章支持结合，那结合还是比较靠谱的。100KD 应该
还算可以，主要你的表达怎么样。
个人建议用MBP（较弱，首选） 或者NUSA,先让你的蛋白不沉淀了再说。另外试试统一
BUFFER， 你AB能用同一种BUFFER吗，如果能，试试吧。在选择CONSTRUCT的时候要仔细
一点比较好，省得后面遭罪。至少要做个2D的ALIGNMENT 和结构的大概预测，相信楼LZ
已经做了。不能打破二级结构是最起码的要求。另外你的蛋白是否正确折叠是个问题。
多做几个CONSTRUCT的备选，费不了多少时间的。
如果经常做蛋白的DYNAMIC，就会对这个对照非常敏感。这里面肯定是有很大不同的。
虽然不太认为是造成你问题的原因，但简单的试一试也无妨。
对，这是终极方法。
现在俺很关注您的这个问题，后... 阅读全帖 |
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l*****5
发帖数: 197 | 25 大家好，现在遇到一个问题不知道怎么解决，希望在此得到帮助，不甚感激！
我用recombinent protein 做一个in vitro assay，最终希望得到一个比较纯，浓度比
较高的dimer，所以一个是His tag，另外一个是GST tag，计划用两次纯化得到最终产
物，其间涉及到另外三种enzyme,实验室以前别人做的，都是His tag。
按理说，整个反应的过程没有多大难度，有一些文章也有receipe，但因为我需要的是
最终的产物，然后再接着往下做别的，所以希望能做的多一些，也需要浓度大一些。但
我已经试了3、4次了，基本上每次做都会缓慢的出现絮状的沉淀，就好像蛋白变性的那
种感觉，会不会是我用的反应浓度比paper上的浓？但我需要的量比较大啊。。。lab以
前的师兄做过，效果还可以，我的浓度是他的5倍，而且总体的量也多很多，他以前做
的量都比较少，也不需要纯化之类的，师兄毕业走人了，而且他一直就用比较稀的浓度。
还有，我试着将离心后的上清过Thermo Pierce的glutathione agarose beads,可以看
到蛋白有吸附（有YFP tag），但我最后... 阅读全帖 |
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z******i
发帖数: 120 | 26 仔细看了一下你的问题，你说的这个分别都挺好，混起来就沉淀，很常见。并非奇葩。
1.A B 是一样的BUFFER 吗？ 不是的话，把A加到B的fuffer里有沉淀不？
2. 给A 和B 全加上SOLUBLE TAG, 比如 MBP 或者更强的 NUSA tag， 不相信你的蛋白
还会沉淀。结构是HELIX BUNDLE 吗？网上预测一下。
3. 蛋白结合DNA/RNA不？ DNAse RNAse 不能除去很彻底。 要用PEI 和 硫酸铵。 另外
，高PI 很容易结合DNA/RNA, 并且在有GST存在的情况下有假结合。这个说来话长。 |
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J*****n
发帖数: 1041 | 27 用TCA沉淀蛋白，溶解蛋白的溶液中有大概1%的去垢剂NP-40，所以在加入Na-
deoxycholate （DOC）就有很多沉淀出来，不知道会不会对蛋白得率有影响？
many thanks in advance!
这个是protocol
1. to one volume protein, add 1/100 volume of 2% DOC, keep on ice for 15 min
2. add 1/10 volume 100% TCA and keep on ice for 1 hr
3. centrifuge at 10,000 g for 10 min at 4C
4. wash the pellet in acetone to get rid of residual TCA
5. resolubilise the pellet in appropriate buffer, and add Laemmli sample
treatment buffer to protein solution
6. SDS-PAGE |
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s******y
发帖数: 28562 | 28 细胞里面的蛋白有各种各样的条件保护着，比方说chaperonin,以及大量的其他蛋白，
所以一个单独的蛋白品种不是那么容易变性，而且细胞里的蛋白是在不停地合成中的，
变性后的东西很快就会被清除掉。
但是在试管里的东西就没有这些保护所以会比较脆弱。而且一旦某个蛋白在体外变性了
，因为没有体内的清除机制，很容易就造成沉淀，然后导致那些本来没有变性的蛋白也
出于疏水力的作用而共沉淀下来。 |
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z******i
发帖数: 120 | 29 不过我还是想问，你说的“先让你的蛋白不沉淀了再说”是指让A+B在一起不沉淀了再
对，是这个意思。
所以，如果换CONSTRUCT的话，可能从根本上解决这个问题。 可能是蛋白DOMAIN的选择
或者DOMAIN边界选择的不好造成的。从个人经验来说，可能最终还要走这一步。只是大
家都普遍不愿意走。
MBP 通常对蛋白结构没有太大影响，MBP本身很容易在通常的BUFFER条件下FOLD的很好
单体，因此与GST相反，会“稀释”一下LOCAL的A+B 浓度（如果A B 结合的话），希望
可以使你的A+B可溶
NUSA可溶性更强，但对这个TAG研究的不多，可以试试。LZ先让你的蛋白A+B可溶了再说
，不然无法往下走。
所以回到那个建议，A的BOUNDARY 选的不对。 LZ如果不愿挑战全长的话。不妨重新设
计一下这个DOMAIN 的CONSTRUCT.
或者走另一端，选择更小的区域，如果能找到一个小段的PPT 和B结合，也是不错。 蛋
白小了，加上TAG就很好HANDLE.但这只能说是个妥协的方案。
另外您的A蛋白能测下CD 或者DLS吗。有SAXS 或者 NMR 简单扫一下就更好。 但这都比
... 阅读全帖 |
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K**********e
发帖数: 188 | 30 350 mM KCl的buffer里的蛋白，加了loading buffer，就生成SDS－K沉淀了。怎么上样
跑SDS PAGE胶啊？加热倒是能
溶解沉淀，但是刚刚吸起来，马上又沉淀了，加到上样孔都是沉淀。
会影响跑胶吗？怎么办呢？（不能加水稀释，因为样品体积就是30ul了，再加loading
buffer，刚刚好） |
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T**********t
发帖数: 1604 | 31 用desalting column试试呢？
或者你把已经有沉淀的样品离心一下，取上清再加点SDS再跑胶。如果你之前加的
loading buffer里的SDS已经把K离子都沉淀下来了的话，应该后来加的SDS就不会沉淀了吧。
不过我不知道你的蛋白是不是也跟SDS一起沉淀了，还是先除盐比较保险。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 32 有几个地方补充一下
2.如果蛋白不纯，比如很多杂带，你怎么确定你要的蛋白在里面？用什么方法？
把符合尺寸的带切下来，送去做质谱
3. 怎么测试蛋白的热稳定性？用什么biopgysics的方法？
一大堆经典方法。自己去查
4. 用质谱测MW，有时有偏离，那么表达后修饰都有那些需要考虑进去？
（不考虑糖基化）
表达后修饰可以直接用质谱来测。只要你告诉对方你有这个需要，他们就会
给你做
5. 怎么确定蛋白是否有糖基化修饰？
质谱是最直接的方法。
6. 蛋白浓缩的时候有沉淀，一般你会怎么办？
严格控制条件，一定要加够DTT. 然后把透析的烧杯密封起来
透析完之后，用高速离心把沉淀成分去掉 |
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s*********t
发帖数: 600 | 33 透析和直接稀释区别何在？文献上都是透析。
比如抽提细胞系的细胞质和核蛋白纯化complex，我一直是这么做的：
harvest 细胞。加5倍细胞pellet体积的低盐溶液（20mM KCl），冰上放10分钟，用
homogenizer捣12次（用tight的B型活塞），3500 rpm离心10min，上清取出，加0.11倍
体积的1.4M KCl，使得终浓度成100mM，我看文献上说要10万g离心若干小时。可是我们这没有这
样的离心机。只能最大速度（5万G）离心1h，作为细胞质抽提物
S100，分装后液氮速冻，-80保存。这一步很难，因为不管离心多久，都有脂状物质悬浮着，得到的
是浑浊的东西。
对于pellet，加两倍体积的420mM KCl。用homogenizer捣若干下，把鼻涕状黏糊糊的东
西充分散开。然后4度摇30min-1h。然后1万2千g离心30min，分装后液氮速冻，再放-80
，作为nuclear extract。
不知道液氮速冻这一步对于防止蛋白变性有好处，还是别的原因？为何需要速冻？
如果用于蛋白复合物的纯化，我以前是用300mM的盐。但是boss让我改成250mM... 阅读全帖 |
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c*******r
发帖数: 440 | 34 借宝地请教：
表达纯化了的MBP融合蛋白，用Factor Xa 酶切后出现沉淀，上清几乎无目标蛋白，目
标蛋白的PI=10 （将来用于结晶）。
通过改变酶切buffer 的 PH，或添加 DDT, glycerol, 盐浓度，还是酶切后还是出现
沉淀。
请分析原因和解决方法，多谢！！！ |
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c*******r
发帖数: 440 | 35 对，蛋白本身可溶性不太好，少量才是可溶的才考虑用MBP融合蛋白表达，但酶切后目
标蛋白几乎全部沉淀，有什么方法可以减少沉淀呢？ 将来还想做晶体研究呢， 急
多谢 |
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g*****p
发帖数: 451 | 36 你说的完全是两个不同的东西
inclusion body通常是蛋白在开始fold的时候就没对，然后疏水区捣腾到一块去，这个
时候沉淀下来的东西是misfold的，这个玩意加点一般的溶剂没法溶解
蛋白沉淀有时候只是盐析或是过饱和，这种情况加点溶剂说不定还能溶解
比如给本科生做的硫酸铵分级沉淀提纯蛋白实验 |
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m****m
发帖数: 395 | 37 用饱和硫酸铵沉淀了蛋白，完全去除上清液后，PELLET用BUFFER溶解，先用PIPET轻轻
把PELLET打碎成小碎片，然后在37C超声水槽里超声，最后还是有微小的蛋白碎片怎么
都不溶解，测了OD280=2左右，也不算很浓啊，这个浓度的时候这个蛋白一般都是溶解
的，测了PH也没有问题。请问该如何让蛋白完全溶解阿？ |
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c******r
发帖数: 3778 | 38 这个SDS钾会沉淀蛋白吗？不是就SDS沉淀嘛？能不能沉淀了离心取上清跑胶？ |
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j*******8
发帖数: 933 | 39 在用丙酮沉淀神经突触前蛋白， 然后溶在0.1% Triton 里， 不过发现溶解性很差，
像细沙子一样不溶。 蛋白是用来跑胶做WB的， 但需要测蛋白浓度， 所以不能直接溶
在SAMPLE BUFFER里。 请问有同修能指点一下吗？ 多谢了！ |
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W*********n
发帖数: 775 | 40 谢谢艳阳天！请问：
我是从小虫子里面分离小胃，不是细胞，洗一洗的作用是啥啊，更干净一些么？
名
想沉淀一下的目的，一来去掉裂解液中的去垢剂，二来浓缩一下蛋白，把样品全部上上
去（这个样品获取比较麻烦，而且解剖时间不能太长）。你说的裂解8M Urea，就是只
有8M Urea溶解在水中？（我得蛋白基础很薄弱）。而且裂解1mg的单层细胞组织需要多
少ul，什么条件下，多久可以彻底裂解？
你是否觉得沉淀蛋白的过程会对phosphotase 有影响？
我们跑质普的实验室一般对一个样品分跑三个泳道，每个泳道切成三份，再对每份进行
MS 分析，所以一个样品要做9个酶切，我做四个样品就要做36个酶切，酶切收费有点贵
，他说可以train我来做，节约开支。 |
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g***s
发帖数: 30 | 41 最近实验室有人在做一个蛋白激酶，这个激酶是和cell adhesion有关，但是不是膜蛋
白，应该只是membrane associated。我们想IP这个蛋白，buffer是1% triton，后来还
加了点SDS。结果每次裂解后，发现离心后上清中蛋白非常少。也尝试过不同的PH，所
以应该也不是等电点沉淀的问题。不知道各位有遇到过类似的问题吗，有什么好的尝试
条件？非常感谢 |
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m****m
发帖数: 395 | 42 假设我现在有 V ml蛋白质，含1%SDS，现要彻底去除SDS，应该加多少摩尔的KCl？才能
使SDS彻底沉淀？（同时更换去垢剂，使得蛋白溶解在另一种去垢剂里，而去除原先的
SDS） 网上说原理是把十二烷基磺酸钠变成十二烷基磺酸钾（不溶），不过我想让蛋白
溶在上清里，不能被盐同时和SDS沉淀了，所以同时加另一种去垢剂。这样的话加多少
KCl合适呢？ |
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g*****y
发帖数: 6325 | 43 你的蛋白本身不好融，你做融合蛋白又切下，当然就又沉淀了。 我要是你根本就不会
浪费时间做融合蛋白。做了就不要
切。 |
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c******e
发帖数: 94 | 44 用acetone沉淀蛋白后怎么样可以让尽量多的蛋白重溶，用的是Ripa buffer。我试过2
次，不管是加热还是超声，
总还是有很多沉淀物化不了。有什么trick没有，谢谢 |
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n*******l
发帖数: 75 | 45 各位大侠们，我在做用6ohda处理细胞的时候，发现一个蛋白的水平降低，文献表明可
能是proteasome（实验是过表达此蛋白，然后用MG132处理，发现蛋白增多；）或者
caspase降解（在细胞中过表达此蛋白和各种caspase酶,发现蛋白降解）。
我于是用proteasome inhibitor MG132与6OHDA 同时处理，并没有发现此蛋白水平回复
（保证MG132其作用，有阳性对照蛋白）。换用caspase inhibitor和6OHDA处理，也没
有发现次蛋白水平回复，换用lysosome inhibitor和6ohda同时处理，也没有发现次蛋
白水平恢复。
请教别人，说proteasome的inhibitor MG132 并不足以阻止proteasome。说一些好的杂
志都不接受MG132作为proteasome的inhibitor。是这样么、？那有什么好的推荐么？
另外一种可能行是我用药物处理之后，蛋白水平下调，是因为我的蛋白沉淀了，在我的
buffer里面是没有的。但是我是用cell signling公司的buffer20mM Tris， 150mM 氯
化钠，1... 阅读全帖 |
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s*******r
发帖数: 769 | 46 1. 如果蛋白很纯，SDS一条带，怎么确定这个蛋白就是你要的蛋白？
N端block了，没法测序；
没有抗体，没法western；
2.如果蛋白不纯，比如很多杂带，你怎么确定你要的蛋白在里面？用什么方法？
3. 怎么测试蛋白的热稳定性？用什么biopgysics的方法？
4. 用质谱测MW，有时有偏离，那么表达后修饰都有那些需要考虑进去？
（不考虑糖基化）
5. 怎么确定蛋白是否有糖基化修饰？
6. 蛋白浓缩的时候有沉淀，一般你会怎么办？
愿闻高见。 |
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m********2
发帖数: 317 | 47 p53免疫共沉淀以及其结构
老板让我免疫共沉淀p53，然后测其结构。我对这一个领域不了解，想问问大家。
第一，有没有好用的kit or protocol来免疫共沉淀p53。
第二，免疫共沉淀出来的p53能否用来测结构。
第三，解构需要的蛋白量是多少?
谢谢大家， |
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C*******e
发帖数: 4348 | 48 不太明白你说的是要得到两个蛋白的复合物，一个his-一个GST-
还是说同一个蛋白，一个version是his-，另一个是GST-
如果是前者，不要太贪心
先用比较稀的浓度得到复合物以后再浓缩
不过有的蛋白就是容易在高浓度下析出
碰到了也没办法
可以试着加点glycerol之类的在溶液里看看有没有帮助（从提蛋白开始）
另外你说的GST-tag那个问题
好像不管用什么tag的话多多少少都会有些蛋白“死”在柱子上
因为你有YFP fusion所以很容易看到了
不代表以前你做的蛋白没有“死”在柱子上的
如果你的GST-tag是可以切除的
试试on column digestion |
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l******n
发帖数: 143 | 49 象前面同学推荐的,光谱类的快速,简单,直接.作为首选很合适.
(1).Fluorescence Emission,最简单的看看tyrosine, tryptophan的化学环境有没有因
为Mg结合而变化,从而对荧光有影响.
(2).同时可以尝试Circular Dichroism,最简单的蛋白二级结构,如果不追究变化的源头
,而只是用变化作为信号去测量金属离子和蛋白作用的,很简单方便.
以上两个方法典型的应用有很多,比如calmodulin和钙离子作用.
注意:因为你需要测的是chemical equilibrium,如果反应很慢的话,需要保证滴定过程
每个滴定点(浓度)都要达到化学反应平衡.
SPR
这个不适合,首先是因为信号来自bulk solution(流动的溶液)中的分子被吸附到固定在
表面的蛋白上形成复合物,本质上因为质量吸附造成sensor surface附近媒介的折射率
改变.所以被吸附的质量大小直接影响了信号强弱.你的实验是Mg在bulk solution,这么
小的离子,几乎不可能产生什么明显的信号.这也是ligand-protein binding里很少用
SPR的... 阅读全帖 |
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m***y
发帖数: 14763 | 50 While we are on it, read this
手机辐射或能预防老年痴呆
信源：BBC｜编辑：2010-01-07｜ 网址：http://www.popyard.org 抄送朋友｜打印保留
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【八阕】郑重声明：本则消息未经严格核实，也不代表《八阕》观点。--[服务使用须
知]【八阕】一个劳动人民群众喜闻乐见的好地方:http://www.popyard.org
八阕 http://www.popyard.org 使用手机是否有损健康的问题长期以来备受关注，研究人员现在发现手机辐射有潜在的益处。
研究人员使用老鼠作试验，研究结果显示手机可能有预防老年痴呆（阿尔茨海默症）功
效。
在佛罗里达的研究人员发现，手机辐射实际上能够保护老鼠记忆当中同患老年痴呆相关
的部分。
佛罗里达老年痴呆症研究中心在《阿尔茨海默症期刊》上发表了他们的研究。
试验中使用了96只老鼠，其中大部分老鼠经过基因改变使老鼠大脑中形成了淀粉状蛋白
沉淀。而随着年龄增长形成淀粉状蛋白沉淀是老年痴呆症的病因。
其余 |
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