l*********g
发帖数: 41 | 1 我这个蛋白大概60多kd，在pet29a上表达还可以。现在我在大概22-23aa那里突变出了
个bamhi位点，然后呢插进去一个15aa的avi-tag，策序什么的都正确，可是表达和纯化
出了问题。
在BLR（DE3）里面表达，只有一次纯化到了我的蛋白，后来就是重复不出来，至少有四
五次了，我检查诱导前后的带，也没有发现明显的表达带，但是即使在我纯化到了蛋白
那次也没有看到明显表达带。我怀疑质粒丢失，但是在overnight培养后也提到了
plasmid，现在真的找不到什么原因了。 以前大概相似蛋白在同样载体上，随便一表达
，至少可以看到一条表达的带，但是现在什么也没有了。我在想即使蛋白折叠不好，但
是至少肽链在那里，电泳也应该看到的，除非它被彻底讲解了，真是郁闷啊。请高手指
点！！ |
l*********g
发帖数: 41 | 2 我每次纯化都是从平板上挑一个克隆，所以从不保留种子，所以那次得到了蛋白也没有
种子：（ |
e****s
发帖数: 1125 | 3 这个只能说教训啊!!!不保存菌株！
另外，有没有比较Sup和inclusion body里面的蛋白量？
是不是可溶蛋白太少了，需要优化诱导条件。
长菌和诱导条件每次都严格一样吗？
【在 l*********g 的大作中提到】
: 我每次纯化都是从平板上挑一个克隆，所以从不保留种子，所以那次得到了蛋白也没有
: 种子：（
|
n****e
发帖数: 1677 | 4 每次都是新转化的平板吗？
【在 l*********g 的大作中提到】
: 我每次纯化都是从平板上挑一个克隆，所以从不保留种子，所以那次得到了蛋白也没有
: 种子：（
|
s****l
发帖数: 395 | 5 pET系列载体的问题就是不能保证每个clone都能表达，一般一次挑5-6个clone然后看看
哪个能诱导吧，有些难表达的蛋白大概只有50%左右的clone可以诱导。
【在 l*********g 的大作中提到】
: 我这个蛋白大概60多kd，在pet29a上表达还可以。现在我在大概22-23aa那里突变出了
: 个bamhi位点，然后呢插进去一个15aa的avi-tag，策序什么的都正确，可是表达和纯化
: 出了问题。
: 在BLR（DE3）里面表达，只有一次纯化到了我的蛋白，后来就是重复不出来，至少有四
: 五次了，我检查诱导前后的带，也没有发现明显的表达带，但是即使在我纯化到了蛋白
: 那次也没有看到明显表达带。我怀疑质粒丢失，但是在overnight培养后也提到了
: plasmid，现在真的找不到什么原因了。 以前大概相似蛋白在同样载体上，随便一表达
: ，至少可以看到一条表达的带，但是现在什么也没有了。我在想即使蛋白折叠不好，但
: 是至少肽链在那里，电泳也应该看到的，除非它被彻底讲解了，真是郁闷啊。请高手指
: 点！！
|
l*********g
发帖数: 41 | 6 上次是用了一个平板，每次我都混合5-6个克隆然后培养，大概试了5-6次，只有一次纯
化到蛋白。这次又做了新的平板，挑了四个克隆，没有一个看到表达的带：（ 真是郁
闷。 |
e****s
发帖数: 1125 | 7 怎么看条带的？
考染还是Western?
【在 l*********g 的大作中提到】
: 上次是用了一个平板，每次我都混合5-6个克隆然后培养，大概试了5-6次，只有一次纯
: 化到蛋白。这次又做了新的平板，挑了四个克隆，没有一个看到表达的带：（ 真是郁
: 闷。
|
k********u
发帖数: 2209 | 8 新的平板，你是指转化后的平板？为什么要混和克隆呢？这不是给自己找麻烦吗。。。
【在 l*********g 的大作中提到】
: 上次是用了一个平板，每次我都混合5-6个克隆然后培养，大概试了5-6次，只有一次纯
: 化到蛋白。这次又做了新的平板，挑了四个克隆，没有一个看到表达的带：（ 真是郁
: 闷。
|
a*******e
发帖数: 245 | 9 ?
I think he/she can pick up more than 2 colonies from plates and inoculate
into LB medium to do expression.
Most time it helps and give good expression.
【在 k********u 的大作中提到】
: 新的平板，你是指转化后的平板？为什么要混和克隆呢？这不是给自己找麻烦吗。。。
|
k********u
发帖数: 2209 | 10 如果他说的新平板是指转化板，这样做的人，不多吧？转化之后当然
要挑单克隆培养，并保种，要不然以后怎么重复。
如果是从保种划出来的板子，这个要看个人习惯的，我个人还是喜欢挑单克隆。
我们实验室比较bt，对单克隆要求很高，转化板上的克隆要重划两次，再进行
下一步操作的。
【在 a*******e 的大作中提到】
: ?
: I think he/she can pick up more than 2 colonies from plates and inoculate
: into LB medium to do expression.
: Most time it helps and give good expression.
|
a*******e
发帖数: 245 | 11 yes, maybe few people do this way. but those colonies are almost the same.
You still can pick up more from
the plate. Sometimes it does help.
【在 k********u 的大作中提到】
: 如果他说的新平板是指转化板，这样做的人，不多吧？转化之后当然
: 要挑单克隆培养，并保种，要不然以后怎么重复。
: 如果是从保种划出来的板子，这个要看个人习惯的，我个人还是喜欢挑单克隆。
: 我们实验室比较bt，对单克隆要求很高，转化板上的克隆要重划两次，再进行
: 下一步操作的。
|
a********k
发帖数: 2273 | 12 用啥做实验放啥上去，很正常啊。就是丑闭了
【在 a*******e 的大作中提到】
: yes, maybe few people do this way. but those colonies are almost the same.
: You still can pick up more from
: the plate. Sometimes it does help.
|
a*******e
发帖数: 245 | 13 what do you mean?
【在 a********k 的大作中提到】
: 用啥做实验放啥上去，很正常啊。就是丑闭了
|
k********u
发帖数: 2209 | 14 Personally, I don't think so.
如果像你所说，都差不多的话，多挑几个克隆，只不过增加点起始的接种量，
诱导前培养快一点，如果每次诱导都在差不多OD，我看不出为什么会对蛋白的产量
有影响。当然，每个人都有自己的做法，有很多不一定是有理论依据的，
有一些近乎superstition了。Do whatever you want if that works for you.
=)
【在 a*******e 的大作中提到】
: yes, maybe few people do this way. but those colonies are almost the same.
: You still can pick up more from
: the plate. Sometimes it does help.
|
