l*********g 发帖数: 41 | 1 我这个蛋白大概60多kd,在pet29a上表达还可以。现在我在大概22-23aa那里突变出了
个bamhi位点,然后呢插进去一个15aa的avi-tag,策序什么的都正确,可是表达和纯化
出了问题。
在BLR(DE3)里面表达,只有一次纯化到了我的蛋白,后来就是重复不出来,至少有四
五次了,我检查诱导前后的带,也没有发现明显的表达带,但是即使在我纯化到了蛋白
那次也没有看到明显表达带。我怀疑质粒丢失,但是在overnight培养后也提到了
plasmid,现在真的找不到什么原因了。 以前大概相似蛋白在同样载体上,随便一表达
,至少可以看到一条表达的带,但是现在什么也没有了。我在想即使蛋白折叠不好,但
是至少肽链在那里,电泳也应该看到的,除非它被彻底讲解了,真是郁闷啊。请高手指
点!! |
l*********g 发帖数: 41 | 2 我每次纯化都是从平板上挑一个克隆,所以从不保留种子,所以那次得到了蛋白也没有
种子:( |
e****s 发帖数: 1125 | 3 这个只能说教训啊!!!不保存菌株!
另外,有没有比较Sup和inclusion body里面的蛋白量?
是不是可溶蛋白太少了,需要优化诱导条件。
长菌和诱导条件每次都严格一样吗?
【在 l*********g 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我每次纯化都是从平板上挑一个克隆,所以从不保留种子,所以那次得到了蛋白也没有 : 种子:(
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n****e 发帖数: 1677 | 4 每次都是新转化的平板吗?
【在 l*********g 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我每次纯化都是从平板上挑一个克隆,所以从不保留种子,所以那次得到了蛋白也没有 : 种子:(
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s****l 发帖数: 395 | 5 pET系列载体的问题就是不能保证每个clone都能表达,一般一次挑5-6个clone然后看看
哪个能诱导吧,有些难表达的蛋白大概只有50%左右的clone可以诱导。
【在 l*********g 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我这个蛋白大概60多kd,在pet29a上表达还可以。现在我在大概22-23aa那里突变出了 : 个bamhi位点,然后呢插进去一个15aa的avi-tag,策序什么的都正确,可是表达和纯化 : 出了问题。 : 在BLR(DE3)里面表达,只有一次纯化到了我的蛋白,后来就是重复不出来,至少有四 : 五次了,我检查诱导前后的带,也没有发现明显的表达带,但是即使在我纯化到了蛋白 : 那次也没有看到明显表达带。我怀疑质粒丢失,但是在overnight培养后也提到了 : plasmid,现在真的找不到什么原因了。 以前大概相似蛋白在同样载体上,随便一表达 : ,至少可以看到一条表达的带,但是现在什么也没有了。我在想即使蛋白折叠不好,但 : 是至少肽链在那里,电泳也应该看到的,除非它被彻底讲解了,真是郁闷啊。请高手指 : 点!!
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l*********g 发帖数: 41 | 6 上次是用了一个平板,每次我都混合5-6个克隆然后培养,大概试了5-6次,只有一次纯
化到蛋白。这次又做了新的平板,挑了四个克隆,没有一个看到表达的带:( 真是郁
闷。 |
e****s 发帖数: 1125 | 7 怎么看条带的?
考染还是Western?
【在 l*********g 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 上次是用了一个平板,每次我都混合5-6个克隆然后培养,大概试了5-6次,只有一次纯 : 化到蛋白。这次又做了新的平板,挑了四个克隆,没有一个看到表达的带:( 真是郁 : 闷。
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k********u 发帖数: 2209 | 8 新的平板,你是指转化后的平板?为什么要混和克隆呢?这不是给自己找麻烦吗。。。
【在 l*********g 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 上次是用了一个平板,每次我都混合5-6个克隆然后培养,大概试了5-6次,只有一次纯 : 化到蛋白。这次又做了新的平板,挑了四个克隆,没有一个看到表达的带:( 真是郁 : 闷。
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a*******e 发帖数: 245 | 9 ?
I think he/she can pick up more than 2 colonies from plates and inoculate
into LB medium to do expression.
Most time it helps and give good expression.
【在 k********u 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 新的平板,你是指转化后的平板?为什么要混和克隆呢?这不是给自己找麻烦吗。。。
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k********u 发帖数: 2209 | 10 如果他说的新平板是指转化板,这样做的人,不多吧?转化之后当然
要挑单克隆培养,并保种,要不然以后怎么重复。
如果是从保种划出来的板子,这个要看个人习惯的,我个人还是喜欢挑单克隆。
我们实验室比较bt,对单克隆要求很高,转化板上的克隆要重划两次,再进行
下一步操作的。
【在 a*******e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : ? : I think he/she can pick up more than 2 colonies from plates and inoculate : into LB medium to do expression. : Most time it helps and give good expression.
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a*******e 发帖数: 245 | 11 yes, maybe few people do this way. but those colonies are almost the same.
You still can pick up more from
the plate. Sometimes it does help.
【在 k********u 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 如果他说的新平板是指转化板,这样做的人,不多吧?转化之后当然 : 要挑单克隆培养,并保种,要不然以后怎么重复。 : 如果是从保种划出来的板子,这个要看个人习惯的,我个人还是喜欢挑单克隆。 : 我们实验室比较bt,对单克隆要求很高,转化板上的克隆要重划两次,再进行 : 下一步操作的。
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a********k 发帖数: 2273 | 12 用啥做实验放啥上去,很正常啊。就是丑闭了
【在 a*******e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : yes, maybe few people do this way. but those colonies are almost the same. : You still can pick up more from : the plate. Sometimes it does help.
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a*******e 发帖数: 245 | 13 what do you mean?
【在 a********k 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 用啥做实验放啥上去,很正常啊。就是丑闭了
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k********u 发帖数: 2209 | 14 Personally, I don't think so.
如果像你所说,都差不多的话,多挑几个克隆,只不过增加点起始的接种量,
诱导前培养快一点,如果每次诱导都在差不多OD,我看不出为什么会对蛋白的产量
有影响。当然,每个人都有自己的做法,有很多不一定是有理论依据的,
有一些近乎superstition了。Do whatever you want if that works for you.
=)
【在 a*******e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : yes, maybe few people do this way. but those colonies are almost the same. : You still can pick up more from : the plate. Sometimes it does help.
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