L******e 发帖数: 679 | 1 最近PCR碰到一个奇怪问题。需要从人的genomic DNA 里PCR一个100到150bp左右的片段
(EGFR)。在第一个exon之前的intron里,设计了好几次引物,还是用PCR-BLAST设计
的。结果每次都出来一个1000bp左右的片段,测序后根本不是我要的那个基因来的(
EGFR)。最离谱的是在这里面(新基因全部的基因序列)尽然找不到我的PCR引物序列
。所用工具为BLAST。用BLAST检查引物又都对。
大家碰到过这种问题吗?劳驾给点建议。谢了。 |
I***a 发帖数: 13467 | 2 100-150应该很好P的,
缩短延伸时间,
1000的应该不出来吧? |
L******e 发帖数: 679 | 3 我用得延伸时间是45秒,出现这个大片断正式奇怪之极 |
l*********s 发帖数: 5409 | 4 1时间太长。
2基因库有问题,比如pseudo gene之类的
【在 L******e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我用得延伸时间是45秒,出现这个大片断正式奇怪之极
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s******r 发帖数: 2876 | 5 200 bp 的片断,10秒钟也足够了,
另外可以试试hotstart,有时候效果不错。
我用得延伸时间是45秒,出现这个大片断正式奇怪之极
【在 L******e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我用得延伸时间是45秒,出现这个大片断正式奇怪之极
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b******n 发帖数: 4225 | 6 “最离谱的是在这里面(新基因全部的基因序列)尽然找不到我的PCR引物序列”
你看看两端跟你的引物有没有部分相似性
其实PCR引物如果3'末端有13个左右碱基相同就有可能P出来的(Tm值不够高的话)
另外你使用BLAST中间的Somewhat similar sequences (blastn)选项
而不是缺省选项megablast
【在 L******e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 最近PCR碰到一个奇怪问题。需要从人的genomic DNA 里PCR一个100到150bp左右的片段 : (EGFR)。在第一个exon之前的intron里,设计了好几次引物,还是用PCR-BLAST设计 : 的。结果每次都出来一个1000bp左右的片段,测序后根本不是我要的那个基因来的( : EGFR)。最离谱的是在这里面(新基因全部的基因序列)尽然找不到我的PCR引物序列 : 。所用工具为BLAST。用BLAST检查引物又都对。 : 大家碰到过这种问题吗?劳驾给点建议。谢了。
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L******e 发帖数: 679 | 7 谢谢各位大侠。我试一下
【在 b******n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : “最离谱的是在这里面(新基因全部的基因序列)尽然找不到我的PCR引物序列” : 你看看两端跟你的引物有没有部分相似性 : 其实PCR引物如果3'末端有13个左右碱基相同就有可能P出来的(Tm值不够高的话) : 另外你使用BLAST中间的Somewhat similar sequences (blastn)选项 : 而不是缺省选项megablast
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h********n 发帖数: 4079 | |
L******e 发帖数: 679 | 9 Yes. All primers are designed with primer-blast. |