L******e
发帖数: 679 | 1 最近PCR碰到一个奇怪问题。需要从人的genomic DNA 里PCR一个100到150bp左右的片段
（EGFR）。在第一个exon之前的intron里，设计了好几次引物，还是用PCR-BLAST设计
的。结果每次都出来一个1000bp左右的片段，测序后根本不是我要的那个基因来的（
EGFR）。最离谱的是在这里面（新基因全部的基因序列）尽然找不到我的PCR引物序列
。所用工具为BLAST。用BLAST检查引物又都对。
大家碰到过这种问题吗？劳驾给点建议。谢了。 |
I***a
发帖数: 13467 | 2 100－150应该很好P的，
缩短延伸时间，
1000的应该不出来吧？ |
L******e
发帖数: 679 | 3 我用得延伸时间是45秒，出现这个大片断正式奇怪之极 |
l*********s
发帖数: 5409 | 4 1时间太长。
2基因库有问题，比如pseudo gene之类的
【在 L******e 的大作中提到】
: 我用得延伸时间是45秒，出现这个大片断正式奇怪之极
|
s******r
发帖数: 2876 | 5 200 bp 的片断，10秒钟也足够了，
另外可以试试hotstart，有时候效果不错。
我用得延伸时间是45秒，出现这个大片断正式奇怪之极
【在 L******e 的大作中提到】
: 我用得延伸时间是45秒，出现这个大片断正式奇怪之极
|
b******n
发帖数: 4225 | 6 “最离谱的是在这里面（新基因全部的基因序列）尽然找不到我的PCR引物序列”
你看看两端跟你的引物有没有部分相似性
其实PCR引物如果3'末端有13个左右碱基相同就有可能P出来的（Tm值不够高的话）
另外你使用BLAST中间的Somewhat similar sequences (blastn)选项
而不是缺省选项megablast
【在 L******e 的大作中提到】
: 最近PCR碰到一个奇怪问题。需要从人的genomic DNA 里PCR一个100到150bp左右的片段
: （EGFR）。在第一个exon之前的intron里，设计了好几次引物，还是用PCR-BLAST设计
: 的。结果每次都出来一个1000bp左右的片段，测序后根本不是我要的那个基因来的（
: EGFR）。最离谱的是在这里面（新基因全部的基因序列）尽然找不到我的PCR引物序列
: 。所用工具为BLAST。用BLAST检查引物又都对。
: 大家碰到过这种问题吗？劳驾给点建议。谢了。
|
L******e
发帖数: 679 | 7 谢谢各位大侠。我试一下
【在 b******n 的大作中提到】
: “最离谱的是在这里面（新基因全部的基因序列）尽然找不到我的PCR引物序列”
: 你看看两端跟你的引物有没有部分相似性
: 其实PCR引物如果3'末端有13个左右碱基相同就有可能P出来的（Tm值不够高的话）
: 另外你使用BLAST中间的Somewhat similar sequences (blastn)选项
: 而不是缺省选项megablast
|
h********n
发帖数: 4079 | |
L******e
发帖数: 679 | 9 Yes. All primers are designed with primer-blast. |
