C*******e 发帖数: 4348 | 1 有个4kb的片段比较难amplify
好不容易折腾得可以P出来了
然后放到TOPO-II里面去测序(blunt end)
5'端好几次都给我奇怪的结果:
amplification序列如果是这样(从PCR的primer开始,测序是在insert位点上下游比较远的地方,
所以能看到back bone):
5'TTAGGCCGGCC.....
我得到的就是这样:
5'GCCGGCC......
本该是PCR forward primer 5'的四个碱基不见了
直接导致一个限制性酶切位点不完全
primer是IDT定的
从IDT订过可能有上千的primer,从来没有遇到过这样的情况
现在我不知道是primer的问题还是有什么别的原因
版上有人遇到过么?
当然我准备定新的primer看看有没有帮助
不过还是百思不得其解这是怎么回事啊 |
c******r 发帖数: 3778 | 2 嗯,可能原因比较多。
1. 不知道你的primer有多长?有没有HPLC purify?如果cloning可能仅仅desalt是不
够的,尤其是比较长的primer。但是5'少掉比较奇怪,一般合成都是3'少掉几个?
2. 不知道你用的什么polymerase?会不会有5’exonuclease activity?
要不你试试随便加4个base pairs再做一下,就算再少4个base pairs也没关系了。
【在 C*******e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 有个4kb的片段比较难amplify : 好不容易折腾得可以P出来了 : 然后放到TOPO-II里面去测序(blunt end) : 5'端好几次都给我奇怪的结果: : amplification序列如果是这样(从PCR的primer开始,测序是在insert位点上下游比较远的地方, : 所以能看到back bone): : 5'TTAGGCCGGCC..... : 我得到的就是这样: : 5'GCCGGCC...... : 本该是PCR forward primer 5'的四个碱基不见了
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l*****i 发帖数: 1163 | 3 紧挨着测序引物的下游会有一段没有测序结果,或者结果不可信。不知道你的测序结果
里面是否可以看到TOPO II的部分序
列。
我在国内的时候碰到过引物上的酶切位点有错误。还有你说的酶切位点不完全是什么意
思?不能切开还是不能完全切开?
【在 C*******e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 有个4kb的片段比较难amplify : 好不容易折腾得可以P出来了 : 然后放到TOPO-II里面去测序(blunt end) : 5'端好几次都给我奇怪的结果: : amplification序列如果是这样(从PCR的primer开始,测序是在insert位点上下游比较远的地方, : 所以能看到back bone): : 5'TTAGGCCGGCC..... : 我得到的就是这样: : 5'GCCGGCC...... : 本该是PCR forward primer 5'的四个碱基不见了
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l*****a 发帖数: 1431 | |
C*******e 发帖数: 4348 | 5 我给出的不是紧挨着测序引物的部分
测序是从insert上下游比较远的地方(>60 bp)开始测的
所以才会很清楚的看到insert 5’比设计的PCR产物少了几个碱基
我说的酶切位点没有了是指本来设计的酶切位点是GGCCGGCC,现在只有GCCGGCC,所以
不切(已经试
验过,而且酶是好的,另外也做过实验跟甲基化没有任何关系)
【在 l*****i 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 紧挨着测序引物的下游会有一段没有测序结果,或者结果不可信。不知道你的测序结果 : 里面是否可以看到TOPO II的部分序 : 列。 : 我在国内的时候碰到过引物上的酶切位点有错误。还有你说的酶切位点不完全是什么意 : 思?不能切开还是不能完全切开?
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C*******e 发帖数: 4348 | 6 你遇到这种情况也是5'端少而不是3'端少么?
在 lischka (smiling cat) 的大作中提到: 】 |
l*****i 发帖数: 1163 | 7 这种情况应该是引物有错误,测序不太可能出错,因为你酶切的结果也支持这点。如果
你实在还不放心,你可以在4kb片段
上设计一个测序引物,反向测序这个区域。
看来你得重新合成引物。看能不能在这4kb中找一个酶切位点(只要这个酶切位点和TPO
或者你的目的载体兼容即可),这
样你就不用再次扩增4kb那么大的片断。
【在 C*******e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我给出的不是紧挨着测序引物的部分 : 测序是从insert上下游比较远的地方(>60 bp)开始测的 : 所以才会很清楚的看到insert 5’比设计的PCR产物少了几个碱基 : 我说的酶切位点没有了是指本来设计的酶切位点是GGCCGGCC,现在只有GCCGGCC,所以 : 不切(已经试 : 验过,而且酶是好的,另外也做过实验跟甲基化没有任何关系)
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C*******e 发帖数: 4348 | 8 谢谢建议
我肯定会重新订引物的
我没有怀疑过测序出错
扩增的4kb片段上设计引物测序比较不可行
这个说起来就话长了
引物都有的
但是因为这个4kb片段比较特殊
没有办法从里面测序
TPO
【在 l*****i 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 这种情况应该是引物有错误,测序不太可能出错,因为你酶切的结果也支持这点。如果 : 你实在还不放心,你可以在4kb片段 : 上设计一个测序引物,反向测序这个区域。 : 看来你得重新合成引物。看能不能在这4kb中找一个酶切位点(只要这个酶切位点和TPO : 或者你的目的载体兼容即可),这 : 样你就不用再次扩增4kb那么大的片断。
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c******r 发帖数: 3778 | 9 你有没有verify一下tube的label上有没有漏掉4个base pairs?
我觉得可能是primer漏了4个base pairs
【在 C*******e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 谢谢建议 : 我肯定会重新订引物的 : 我没有怀疑过测序出错 : 扩增的4kb片段上设计引物测序比较不可行 : 这个说起来就话长了 : 引物都有的 : 但是因为这个4kb片段比较特殊 : 没有办法从里面测序 : : TPO
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C*******e 发帖数: 4348 | 10 呃,这个倒真没查
会查一下
不过还是准备重新定primer
再多加几个碱基
【在 c******r 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 你有没有verify一下tube的label上有没有漏掉4个base pairs? : 我觉得可能是primer漏了4个base pairs
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l*****a 发帖数: 1431 | 11 对,是5’端少的,linker没了。作PCR看着是正确的条带,回收后作连接,怎么也连不
上。后来TA克隆测序发现linker没了。只好重新order引物。
【在 C*******e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 你遇到这种情况也是5'端少而不是3'端少么? : 在 lischka (smiling cat) 的大作中提到: 】
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s******s 发帖数: 13035 | 12 长的引物错误是有可能的,我们当年也有一个Linker合成错了,
搞了两三个月才figure out是怎么回事
较远的地方,
【在 C*******e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 有个4kb的片段比较难amplify : 好不容易折腾得可以P出来了 : 然后放到TOPO-II里面去测序(blunt end) : 5'端好几次都给我奇怪的结果: : amplification序列如果是这样(从PCR的primer开始,测序是在insert位点上下游比较远的地方, : 所以能看到back bone): : 5'TTAGGCCGGCC..... : 我得到的就是这样: : 5'GCCGGCC...... : 本该是PCR forward primer 5'的四个碱基不见了
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C*******e 发帖数: 4348 | 13 ft,居然还有这种事情
我以为只有3‘会少
不过24nts就合成错也太搞笑了吧
唉
【在 l*****a 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 对,是5’端少的,linker没了。作PCR看着是正确的条带,回收后作连接,怎么也连不 : 上。后来TA克隆测序发现linker没了。只好重新order引物。
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y******g 发帖数: 3 | |
C*******e 发帖数: 4348 | 15 还真是不知道
这下明白了
【在 y******g 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 引物合成是从3’到5’的,现在明白了吧?
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b****r 发帖数: 17995 | 16 楼主记得回来讲讲,最后是不是IDT合成引物的问题?
你那测序结果后面的序列都对吗 |
b******n 发帖数: 4225 | 17 太长的引物容易出这种问题
有次我的几个引物(50-60nt)的5'都缺一个A
而我当时不知道,只按照25nm的scale合成
后来他们客服解释说合成时每一个nt正确添加的效率是99%
那么60个nt的引物合成下来最终产物中正确的只有55%
因为引物是从3'->5'合成的,所以5'很容易有deletion
他们建议超过60nt的引物合成使用100nm的scale(每步合成效率达到99.5%)
较远的地方,
【在 C*******e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 有个4kb的片段比较难amplify : 好不容易折腾得可以P出来了 : 然后放到TOPO-II里面去测序(blunt end) : 5'端好几次都给我奇怪的结果: : amplification序列如果是这样(从PCR的primer开始,测序是在insert位点上下游比较远的地方, : 所以能看到back bone): : 5'TTAGGCCGGCC..... : 我得到的就是这样: : 5'GCCGGCC...... : 本该是PCR forward primer 5'的四个碱基不见了
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s*****k 发帖数: 2297 | |