b******3 发帖数: 377 | 1 核磁出来没多少峰,导师认为蛋白没有折叠,大肠表达,纯化什么的都没问题,怎么办
?谢谢! |
m**z 发帖数: 787 | 2 NMR没有多少峰的原因很多吧,比如蛋白太大或者多聚,multiple conformational
state等等。。 反正我之前作的一个蛋白,肯定fold是没有问题的(nice alpha-
helical structure by CD and even crystal structure),NMR出来就是没有几个峰。
我觉得不能用这个来推断没有folding.
相反,没有folding的蛋白据我理解应该有很多峰,只不过这些峰不disperse,全部集中
在HSQC中间的地方,这个好像是没有folding的一个特征。
CD应该是相对容易得看蛋白有没有folding得不错的方法
【在 b******3 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 核磁出来没多少峰,导师认为蛋白没有折叠,大肠表达,纯化什么的都没问题,怎么办 : ?谢谢!
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C*********m 发帖数: 213 | 3
15N HSQC 没有多少峰?那 一维氢谱的methyl区呢?
【在 b******3 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 核磁出来没多少峰,导师认为蛋白没有折叠,大肠表达,纯化什么的都没问题,怎么办 : ?谢谢!
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J********n 发帖数: 534 | 4 没错,看看1D的,就知道折叠没有了。
我们这里,小蛋白做结构前,通常都会扫一下1D,看看methy和aromatic区间有没有明
显的shift。
没有的话,有可能就是没折叠好,还有可能蛋白本身就是属于intrinsically
disordered。需要找到binding partner才能有稳定的结构。
【在 C*********m 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : : 15N HSQC 没有多少峰?那 一维氢谱的methyl区呢?
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b******3 发帖数: 377 | 5 楼上几位都太给力了,能不能给一些文献参考一下!这个19K的蛋白,还只是一个
domain,还是预测的序列,如果还是多聚,我就不用毕业了。
【在 m**z 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : NMR没有多少峰的原因很多吧,比如蛋白太大或者多聚,multiple conformational : state等等。。 反正我之前作的一个蛋白,肯定fold是没有问题的(nice alpha- : helical structure by CD and even crystal structure),NMR出来就是没有几个峰。 : 我觉得不能用这个来推断没有folding. : 相反,没有folding的蛋白据我理解应该有很多峰,只不过这些峰不disperse,全部集中 : 在HSQC中间的地方,这个好像是没有folding的一个特征。 : CD应该是相对容易得看蛋白有没有folding得不错的方法
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p****s 发帖数: 3153 | 6 测测correlation time,也许知道是不是多聚了。我觉得是多聚的可能性比较大,就算
是没折叠的,也不会峰很少
要不做做H-C HMQC,不过估计比较贵,哈哈
【在 b******3 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 楼上几位都太给力了,能不能给一些文献参考一下!这个19K的蛋白,还只是一个 : domain,还是预测的序列,如果还是多聚,我就不用毕业了。
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m**z 发帖数: 787 | 7 你是必须要做结构吗?如果是对于一个新蛋白,做一些基本的biochemistry
characterization不可以吗?
【在 b******3 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 楼上几位都太给力了,能不能给一些文献参考一下!这个19K的蛋白,还只是一个 : domain,还是预测的序列,如果还是多聚,我就不用毕业了。
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s****7 发帖数: 176 | 8 貌似没这么简单吧
【在 m**z 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 你是必须要做结构吗?如果是对于一个新蛋白,做一些基本的biochemistry : characterization不可以吗?
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b******3 发帖数: 377 | 9 就是做结构的。。。
CD谱蛋白浓度多少?1mg/mL行不?主要是盐浓度有50mM phosphate,有问题没?
【在 m**z 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 你是必须要做结构吗?如果是对于一个新蛋白,做一些基本的biochemistry : characterization不可以吗?
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m**z 发帖数: 787 | 10 CD需要的蛋白量是很少的,一般~10 uM,就可以了,体积应该是400-500ul的样子,不同
的仪器和cuvette可能会不同。50 mM phosphate有一点高,另外NaCl也会影响。不过这
些影响主要都在far UV region (180-200nm).对于看二级结构的话应该影响不大
【在 b******3 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 就是做结构的。。。 : CD谱蛋白浓度多少?1mg/mL行不?主要是盐浓度有50mM phosphate,有问题没?
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s********n 发帖数: 2939 | 11 过一个简单的size exclusion就知道是否多聚了,没必要这么复杂吧?
【在 p****s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 测测correlation time,也许知道是不是多聚了。我觉得是多聚的可能性比较大,就算 : 是没折叠的,也不会峰很少 : 要不做做H-C HMQC,不过估计比较贵,哈哈
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m**z 发帖数: 787 | 12 做结构的lab... NMR的确不一定每个蛋白都能做的。。。可以试试看不同的buffer条件
,包括pH,盐浓度等。我知道NMR对于这些条件的容忍度不是很高,不过还是可以一试。
还有就是你的HSQC是什么温度run的呢?如果只是25度的话,试试看提高温度到35甚至
40度,也许能有好一点的谱也不一定(当然你的蛋白要够稳定。。。)
我不是做结构的,不过我以前一个蛋白也试过NMR,那个时候晶体结构已经有了。25度的
时候也是只有几个peak,40度的时候好很多。后来发现蛋白会形成tetramer.可能提高温
度有利于某一种state,所以能看到不少峰。我们认为应该就是这个tetramer...这样的
话就是一个45kDa的分子。后来有人还试过full deuteration.谱又好了很多,不过还是
不ideal...现在不知道还有没有人再努力。。。所以我觉得有时候NMR条件的优化是得
益于你对这个蛋白性质的了解得。
或者能不能同时也试试看crystal呢?也许能多一点机会。
【在 b******3 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 就是做结构的。。。 : CD谱蛋白浓度多少?1mg/mL行不?主要是盐浓度有50mM phosphate,有问题没?
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s********n 发帖数: 2939 | 13 外行请问NMR能够在高温下做么?比如60-100 degree C.
【在 m**z 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 做结构的lab... NMR的确不一定每个蛋白都能做的。。。可以试试看不同的buffer条件 : ,包括pH,盐浓度等。我知道NMR对于这些条件的容忍度不是很高,不过还是可以一试。 : 还有就是你的HSQC是什么温度run的呢?如果只是25度的话,试试看提高温度到35甚至 : 40度,也许能有好一点的谱也不一定(当然你的蛋白要够稳定。。。) : 我不是做结构的,不过我以前一个蛋白也试过NMR,那个时候晶体结构已经有了。25度的 : 时候也是只有几个peak,40度的时候好很多。后来发现蛋白会形成tetramer.可能提高温 : 度有利于某一种state,所以能看到不少峰。我们认为应该就是这个tetramer...这样的 : 话就是一个45kDa的分子。后来有人还试过full deuteration.谱又好了很多,不过还是 : 不ideal...现在不知道还有没有人再努力。。。所以我觉得有时候NMR条件的优化是得 : 益于你对这个蛋白性质的了解得。
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b******3 发帖数: 377 | 14 我们老板的意思是基本上提出来不折叠就不折叠了,废那个劲换buffer,调温度,不如
直接换个sequence再试。唉,再撞撞运气吧。多谢了。
【在 m**z 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 做结构的lab... NMR的确不一定每个蛋白都能做的。。。可以试试看不同的buffer条件 : ,包括pH,盐浓度等。我知道NMR对于这些条件的容忍度不是很高,不过还是可以一试。 : 还有就是你的HSQC是什么温度run的呢?如果只是25度的话,试试看提高温度到35甚至 : 40度,也许能有好一点的谱也不一定(当然你的蛋白要够稳定。。。) : 我不是做结构的,不过我以前一个蛋白也试过NMR,那个时候晶体结构已经有了。25度的 : 时候也是只有几个peak,40度的时候好很多。后来发现蛋白会形成tetramer.可能提高温 : 度有利于某一种state,所以能看到不少峰。我们认为应该就是这个tetramer...这样的 : 话就是一个45kDa的分子。后来有人还试过full deuteration.谱又好了很多,不过还是 : 不ideal...现在不知道还有没有人再努力。。。所以我觉得有时候NMR条件的优化是得 : 益于你对这个蛋白性质的了解得。
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m**z 发帖数: 787 | 15 那么高倒是没有听说过... 蛋白的话那么高温度能稳定不沉淀嘛。。
【在 s********n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 外行请问NMR能够在高温下做么?比如60-100 degree C.
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p****s 发帖数: 3153 | 16 我见过有70度条件下做的,但是取决于蛋白。如果蛋白在那个温度下要变性自然就不行了
【在 s********n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 外行请问NMR能够在高温下做么?比如60-100 degree C.
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p****s 发帖数: 3153 | 17 提高温度是提高分子tumbling的速度,减小correlation time,延长弛豫时间,嗯
可能还是分子量太大了,25k以上似乎就要用一些特殊手段来做
【在 m**z 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 做结构的lab... NMR的确不一定每个蛋白都能做的。。。可以试试看不同的buffer条件 : ,包括pH,盐浓度等。我知道NMR对于这些条件的容忍度不是很高,不过还是可以一试。 : 还有就是你的HSQC是什么温度run的呢?如果只是25度的话,试试看提高温度到35甚至 : 40度,也许能有好一点的谱也不一定(当然你的蛋白要够稳定。。。) : 我不是做结构的,不过我以前一个蛋白也试过NMR,那个时候晶体结构已经有了。25度的 : 时候也是只有几个peak,40度的时候好很多。后来发现蛋白会形成tetramer.可能提高温 : 度有利于某一种state,所以能看到不少峰。我们认为应该就是这个tetramer...这样的 : 话就是一个45kDa的分子。后来有人还试过full deuteration.谱又好了很多,不过还是 : 不ideal...现在不知道还有没有人再努力。。。所以我觉得有时候NMR条件的优化是得 : 益于你对这个蛋白性质的了解得。
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o****e 发帖数: 1011 | 18 楼主做CD怕信号小的话,可以用path length大些的cuvette。
(不过需要的volume也要相对多一点儿)
【在 m**z 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : CD需要的蛋白量是很少的,一般~10 uM,就可以了,体积应该是400-500ul的样子,不同 : 的仪器和cuvette可能会不同。50 mM phosphate有一点高,另外NaCl也会影响。不过这 : 些影响主要都在far UV region (180-200nm).对于看二级结构的话应该影响不大
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s********n 发帖数: 2939 | 19 我有一个热稳定的蛋白,Tm>90C,在70和90C有一些不同的特性,通过MD simulation发
现蛋白结构的一些区域在不同温度下有一些有意思的现象,比如说有几个区域在90度
RMSF比在70C下大很多(这很正常),但有一个区域70C比90C大很多,这个现象可能可
以和这个蛋白在这两个温度下的不同特性相联系。
现在就是除了做mutation外,能否用一些生物物理的方法来检测。CD是可以检测整个蛋
白的构象变化,但好像不能检测到区域。所以想问问NMR能否在高温下做?现在能够做
到多大蛋白(我的蛋白大概35 kda)?NMR能否检测到蛋白结构中不同区域的变化?
行了
【在 p****s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我见过有70度条件下做的,但是取决于蛋白。如果蛋白在那个温度下要变性自然就不行了
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p****s 发帖数: 3153 | 20 我觉得大小不成问题...但是能做那么高温度的NMR仪器估计不好找,问问你所在学校吧
70-90C的条件下,蛋白转得很快了吧,35kd应该很合适。NMR可以做很高分辨的东西,
比如CPMG可以做每个残基的动
力学变化。我觉得关键还是有没有能做这么高温度的仪器。
【在 s********n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我有一个热稳定的蛋白,Tm>90C,在70和90C有一些不同的特性,通过MD simulation发 : 现蛋白结构的一些区域在不同温度下有一些有意思的现象,比如说有几个区域在90度 : RMSF比在70C下大很多(这很正常),但有一个区域70C比90C大很多,这个现象可能可 : 以和这个蛋白在这两个温度下的不同特性相联系。 : 现在就是除了做mutation外,能否用一些生物物理的方法来检测。CD是可以检测整个蛋 : 白的构象变化,但好像不能检测到区域。所以想问问NMR能否在高温下做?现在能够做 : 到多大蛋白(我的蛋白大概35 kda)?NMR能否检测到蛋白结构中不同区域的变化? : : 行了
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m**z 发帖数: 787 | 21 re 这个。只要有合适的NMR,纯化一些N15-label的蛋白,试试看,也许就能知道有没有
希望work了。这个从时间和钱上面来讲都不算需要花费很多。
【在 p****s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我觉得大小不成问题...但是能做那么高温度的NMR仪器估计不好找,问问你所在学校吧 : 70-90C的条件下,蛋白转得很快了吧,35kd应该很合适。NMR可以做很高分辨的东西, : 比如CPMG可以做每个残基的动 : 力学变化。我觉得关键还是有没有能做这么高温度的仪器。
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C*********m 发帖数: 213 | 22 到了70度,amide proton的交换非常快,用15N标记估计也看不到什么东西。
【在 m**z 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : re 这个。只要有合适的NMR,纯化一些N15-label的蛋白,试试看,也许就能知道有没有 : 希望work了。这个从时间和钱上面来讲都不算需要花费很多。
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s********n 发帖数: 2939 | 23 像这种情况表达的蛋白需要C13和N15都标记吗? |
s********n 发帖数: 2939 | 24 这个是什么意思?NMR不是检测H1, N15和C13么?
【在 C*********m 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 到了70度,amide proton的交换非常快,用15N标记估计也看不到什么东西。
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p****s 发帖数: 3153 | 25 好像也可以做的,不一定会被交换掉。对于常用的HSQC来说,是从H开始到N然后再到H,靠的是J-
coupling,而一开始的信号来自amide上的H,amide上的H可以和水交换。如果交换速度
太快,这个H就观测不到了。不过看起来如果有氢键(二级结构)存在的话,交换速度会慢很多。别
的常用的3D NMR方法都是建立在HSQC的基础上。你可以看看下面的文章,一个49kD的蛋白(寡聚),
在80C条件下做的。
http://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/ja1064608
【在 s********n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 这个是什么意思?NMR不是检测H1, N15和C13么?
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p****s 发帖数: 3153 | 26 如果没有以前的assignments必须用C13,否则没法进行assignment。说不定还要用D
【在 s********n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 像这种情况表达的蛋白需要C13和N15都标记吗?
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s********n 发帖数: 2939 | 27 我大概查了一下,Brown U好像可以做到-150 to 160 C,还有其他几个Universities也
可以做。
有几个问题想请教一下:
1. 文章提到他们的蛋白用N15, C13 label,有的用D2/C13 label,这是两个实验么?
还是说这个蛋白需要用三种标记?
2. 用D2/C13 label的蛋白在纯化过程中用的是普通的水还是D2O?
3. N15/C13 label的蛋白纯化需要用特殊的试剂么?比如说是否需要杜绝带有N14/C12
的试剂?
4. 整个过程如果顺利的话需要多少时间?我在考虑是否值得花这么大的力气去做。
H,靠的是J-
度会慢很多。别
蛋白(寡聚),
【在 p****s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 好像也可以做的,不一定会被交换掉。对于常用的HSQC来说,是从H开始到N然后再到H,靠的是J- : coupling,而一开始的信号来自amide上的H,amide上的H可以和水交换。如果交换速度 : 太快,这个H就观测不到了。不过看起来如果有氢键(二级结构)存在的话,交换速度会慢很多。别 : 的常用的3D NMR方法都是建立在HSQC的基础上。你可以看看下面的文章,一个49kD的蛋白(寡聚), : 在80C条件下做的。 : http://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/ja1064608
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m**z 发帖数: 787 | 28 here are what i know:
1. D2 label是对于比较大的蛋白质比较有用的方法。我觉得第一步通常只是N15标记,
这个便宜。然后根据得到的结果考虑要不要继续以及如何继续。要做assignment,N15/
C13-label是必须的。D2 根据需要把
2&3.no special reagen required during purification, otherwise it will be way
too expensive.
4.纯化过程并无区别,蛋白的表达可能需要优化。如果你的蛋白在LB表达很好的话,应
该不用担心。当然D2 标记的话可能还要考虑e.coli的grow.具体要参考文献。我只做过
N15label,其他的都是实验室其他人做的。我也不清楚如果一切顺利的话,从开始到
assignment到得到你需要的数据需要多久。。。
C12
【在 s********n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我大概查了一下,Brown U好像可以做到-150 to 160 C,还有其他几个Universities也 : 可以做。 : 有几个问题想请教一下: : 1. 文章提到他们的蛋白用N15, C13 label,有的用D2/C13 label,这是两个实验么? : 还是说这个蛋白需要用三种标记? : 2. 用D2/C13 label的蛋白在纯化过程中用的是普通的水还是D2O? : 3. N15/C13 label的蛋白纯化需要用特殊的试剂么?比如说是否需要杜绝带有N14/C12 : 的试剂? : 4. 整个过程如果顺利的话需要多少时间?我在考虑是否值得花这么大的力气去做。 :
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p****s 发帖数: 3153 | 29 1. 没看文章不清楚,我觉得应该是大部分样品都是D,13C和15N标记
2. 纯化过程是用普通水,表达过程中用重水
3. 不需要,都是蛋白呀,C和N在蛋白里是稳定的原子,不会和别的发生交换。amide H
(D)和OH的
H(D)可以与水中的H交换,这也是D代蛋白里HSQC的H信号的来源
4. 不知道需要多少时间,取决于你的谱的质量,你可以先用D和15N标记看看HSQC的谱
怎么样。或者不
用D先看看。如果峰特窄的话就有往下面做的意义,不过我觉得基本没什么问题。其实
我没做过
solution NMR解谱...一般的蛋白从得到谱算一个月怎么样都能解出来了。不过你的蛋
白太大,我估
计可能要用一些4D的方法吧。
C12
【在 s********n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我大概查了一下,Brown U好像可以做到-150 to 160 C,还有其他几个Universities也 : 可以做。 : 有几个问题想请教一下: : 1. 文章提到他们的蛋白用N15, C13 label,有的用D2/C13 label,这是两个实验么? : 还是说这个蛋白需要用三种标记? : 2. 用D2/C13 label的蛋白在纯化过程中用的是普通的水还是D2O? : 3. N15/C13 label的蛋白纯化需要用特殊的试剂么?比如说是否需要杜绝带有N14/C12 : 的试剂? : 4. 整个过程如果顺利的话需要多少时间?我在考虑是否值得花这么大的力气去做。 :
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p****s 发帖数: 3153 | 30 我建议你找一个NMR合作者,这点东西如果不是专门做NMR的不会投入很大精力。做出来
你们都有
credit,做不出来你也不亏什么。
你可以做做别的生化和生物物理,比如CD,热变性什么的。如果想得到残基尺度的动力
学信息,做NMR
是最好了。(其实别的生物物理方法我也不是懂太多...)
C12
【在 s********n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我大概查了一下,Brown U好像可以做到-150 to 160 C,还有其他几个Universities也 : 可以做。 : 有几个问题想请教一下: : 1. 文章提到他们的蛋白用N15, C13 label,有的用D2/C13 label,这是两个实验么? : 还是说这个蛋白需要用三种标记? : 2. 用D2/C13 label的蛋白在纯化过程中用的是普通的水还是D2O? : 3. N15/C13 label的蛋白纯化需要用特殊的试剂么?比如说是否需要杜绝带有N14/C12 : 的试剂? : 4. 整个过程如果顺利的话需要多少时间?我在考虑是否值得花这么大的力气去做。 :
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m**z 发帖数: 787 | 31 同意。都自己来的话,就算谱图都好,那些软件什么的都得捉摸挺长时间。那些东西都
学会,在作出需要的结果,都快大半个PhD了。。。
【在 p****s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我建议你找一个NMR合作者,这点东西如果不是专门做NMR的不会投入很大精力。做出来 : 你们都有 : credit,做不出来你也不亏什么。 : 你可以做做别的生化和生物物理,比如CD,热变性什么的。如果想得到残基尺度的动力 : 学信息,做NMR : 是最好了。(其实别的生物物理方法我也不是懂太多...) : : C12
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m**z 发帖数: 787 | 32 H-D exchange mass-spec is another way for dynamics study.
【在 p****s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我建议你找一个NMR合作者,这点东西如果不是专门做NMR的不会投入很大精力。做出来 : 你们都有 : credit,做不出来你也不亏什么。 : 你可以做做别的生化和生物物理,比如CD,热变性什么的。如果想得到残基尺度的动力 : 学信息,做NMR : 是最好了。(其实别的生物物理方法我也不是懂太多...) : : C12
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p****s 发帖数: 3153 | 33 也可以用HX NMR,哈哈
总觉得mass spec分辨率不太好,嗯,当然跟NMR好像是互补的
【在 m**z 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : H-D exchange mass-spec is another way for dynamics study.
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m**z 发帖数: 787 | 34 那是啊,这不是在寻找alternative method嘛。。。:)
【在 p****s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 也可以用HX NMR,哈哈 : 总觉得mass spec分辨率不太好,嗯,当然跟NMR好像是互补的
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s********n 发帖数: 2939 | 35 Thank mmzz and prales!
我就不一一回复了,你们的回帖解决了我的大部分疑问,如果我决定做的话肯定是找合
作者的,我也就了解一下原理和背景就行了。我也想用其他的生物物理的方法,但就我
所知好像没有其他特别合适的(H-D exchange mass-spec能够检测到residue么?)。
我的蛋白表达量挺高的,纯化也很简单(一步),希望在我可控的范围内不会有太大的
问题。呵呵! |
m**z 发帖数: 787 | 36 H-D exchange mass-spec是可以做到residue specific的,但不能cover整个蛋白,
coverage可能在70-80%就不错了,分辨率和coverage取决于蛋白非特异性酶切后产生的
片断的overlap.
【在 s********n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : Thank mmzz and prales! : 我就不一一回复了,你们的回帖解决了我的大部分疑问,如果我决定做的话肯定是找合 : 作者的,我也就了解一下原理和背景就行了。我也想用其他的生物物理的方法,但就我 : 所知好像没有其他特别合适的(H-D exchange mass-spec能够检测到residue么?)。 : 我的蛋白表达量挺高的,纯化也很简单(一步),希望在我可控的范围内不会有太大的 : 问题。呵呵!
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s********n 发帖数: 2939 | 37 I really appreciate your help!
【在 m**z 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : H-D exchange mass-spec是可以做到residue specific的,但不能cover整个蛋白, : coverage可能在70-80%就不错了,分辨率和coverage取决于蛋白非特异性酶切后产生的 : 片断的overlap.
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