n***g 发帖数: 5027 | 1 本人没有这方面的经验,有没有好的建议和protocol呢?
比如,DNA大小?
O(∩_∩)O谢谢 |
n***g 发帖数: 5027 | |
s****l 发帖数: 395 | 3 primer合成时加biotin,一般可以到80nt,DNA大小限制应该不大,几kb应该都能
pulldown下来的
【在 n***g 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 本人没有这方面的经验,有没有好的建议和protocol呢? : 比如,DNA大小? : O(∩_∩)O谢谢
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s******s 发帖数: 13035 | 4 没看懂。你想用啥pull啥?用DNA probe去pull其他东西?
【在 n***g 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 本人没有这方面的经验,有没有好的建议和protocol呢? : 比如,DNA大小? : O(∩_∩)O谢谢
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o**4 发帖数: 35028 | 5 20bp的DNA可以么?
【在 s****l 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : primer合成时加biotin,一般可以到80nt,DNA大小限制应该不大,几kb应该都能 : pulldown下来的
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o**4 发帖数: 35028 | 6 用DNA可以pull down 跟它结合的蛋白质么?
【在 s******s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 没看懂。你想用啥pull啥?用DNA probe去pull其他东西?
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T**********t 发帖数: 1604 | 7 就像3楼所说,biotin可以在合成引物的时候直接label在5'端。正常的引物长度都可以
,也不贵。需要更长的片段可以用label好的引物去跑个PCR,和普通PCR的条件是一样
的。跑完PCR之后,用streptavidin beads可以直接把带biotin label的片段和其他片
段分开。 |
s******s 发帖数: 13035 | 8 当然啦
【在 o**4 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 用DNA可以pull down 跟它结合的蛋白质么?
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s******s 发帖数: 13035 | 9 你到底是用DNA pull啥?只要DNA,多长都可以,不过毫无意义。
要pull蛋白,20bp估计太小了吧?要pull其他的DNA,20bp不够
牢,一般用LNA,PNA一类的
【在 o**4 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 20bp的DNA可以么?
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s******s 发帖数: 13035 | 10 一般比较段的就用引物了,比较长的,尤其要求结合比较牢的,可以
nick translation
【在 T**********t 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 就像3楼所说,biotin可以在合成引物的时候直接label在5'端。正常的引物长度都可以 : ,也不贵。需要更长的片段可以用label好的引物去跑个PCR,和普通PCR的条件是一样 : 的。跑完PCR之后,用streptavidin beads可以直接把带biotin label的片段和其他片 : 段分开。
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o**4 发帖数: 35028 | 11 O(∩_∩)O谢谢,就是不知道用多长的DNA做pull down合适。 20bp是不是太小了?
【在 T**********t 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 就像3楼所说,biotin可以在合成引物的时候直接label在5'端。正常的引物长度都可以 : ,也不贵。需要更长的片段可以用label好的引物去跑个PCR,和普通PCR的条件是一样 : 的。跑完PCR之后,用streptavidin beads可以直接把带biotin label的片段和其他片 : 段分开。
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o**4 发帖数: 35028 | 12 用DNA pull蛋白质
【在 s******s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 你到底是用DNA pull啥?只要DNA,多长都可以,不过毫无意义。 : 要pull蛋白,20bp估计太小了吧?要pull其他的DNA,20bp不够 : 牢,一般用LNA,PNA一类的
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o**4 发帖数: 35028 | 13
~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~这个怎么做啊?引物最长能合成多长啊?
【在 s******s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 一般比较段的就用引物了,比较长的,尤其要求结合比较牢的,可以 : nick translation
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W****C 发帖数: 1937 | 14
20bp不小 很多都是用这么大的 完全可以包括binding sites
【在 s******s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 你到底是用DNA pull啥?只要DNA,多长都可以,不过毫无意义。 : 要pull蛋白,20bp估计太小了吧?要pull其他的DNA,20bp不够 : 牢,一般用LNA,PNA一类的
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o**4 发帖数: 35028 | 15 能不能帮忙弄到一篇参考文献啊?
O(∩_∩)O谢谢
【在 W****C 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : : 20bp不小 很多都是用这么大的 完全可以包括binding sites
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T**********t 发帖数: 1604 | 16 你和nanog是分身啊?
Analysis of Protein-DNA Binding by Streptavidin-Agarose Pulldown
Kenneth K. Wu
Gene Mapping, Discovery, and Expression
Methods in Molecular Biology, 2006, Volume 338, 281-290, DOI: 10.1385/1-
59745-097-9:281
http://www.springerlink.com/content/j274505582u54474/fulltext.p
【在 o**4 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 能不能帮忙弄到一篇参考文献啊? : O(∩_∩)O谢谢
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o**4 发帖数: 35028 | 17 太感谢了啊,
我这有个enhancer,只有20bp,
你说我是用这个20bp去拉蛋白呢?还是用更长的DNA去拉蛋白比较好呢?
另外,多长最合适呢?
O(∩_∩)O谢谢
【在 T**********t 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 你和nanog是分身啊? : Analysis of Protein-DNA Binding by Streptavidin-Agarose Pulldown : Kenneth K. Wu : Gene Mapping, Discovery, and Expression : Methods in Molecular Biology, 2006, Volume 338, 281-290, DOI: 10.1385/1- : 59745-097-9:281 : http://www.springerlink.com/content/j274505582u54474/fulltext.p
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s******s 发帖数: 13035 | 18 要有六七个bp浪费在linker上吧
【在 W****C 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : : 20bp不小 很多都是用这么大的 完全可以包括binding sites
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s******s 发帖数: 13035 | 19 这个是长的probe,普通的PCR产物或者plasmid, 用DNaseI随机切出nick,
然后用klenow还是啥重新合成片段掺入biotin。长度大概200bp-500bp,
取决于反应时间,时间越长,DNaseI的nick越多,片段越短
【在 o**4 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 太感谢了啊, : 我这有个enhancer,只有20bp, : 你说我是用这个20bp去拉蛋白呢?还是用更长的DNA去拉蛋白比较好呢? : 另外,多长最合适呢? : O(∩_∩)O谢谢
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s******s 发帖数: 13035 | 20 btw, 这个roche有mix, 酶/buffer/dNTP/biotin-dCTP啥的都混在一起,
加到DNA里面温浴一下就好了。
【在 s******s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 这个是长的probe,普通的PCR产物或者plasmid, 用DNaseI随机切出nick, : 然后用klenow还是啥重新合成片段掺入biotin。长度大概200bp-500bp, : 取决于反应时间,时间越长,DNaseI的nick越多,片段越短
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T**********t 发帖数: 1604 | 21 其实我自己没做过pull down。。。说错了的话,谢绝追杀。
如果你知道你的binding motif是什么序列,在它前面加5-10bp的linker一般就够了吧
我觉得。不过要先用mfold或者类似的软件看一下你加的linker不会影响到你需要的那
个binding motif的二级结构。
【在 o**4 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 太感谢了啊, : 我这有个enhancer,只有20bp, : 你说我是用这个20bp去拉蛋白呢?还是用更长的DNA去拉蛋白比较好呢? : 另外,多长最合适呢? : O(∩_∩)O谢谢
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o**4 发帖数: 35028 | 22 哦,这个挺好的,也许我要用到
【在 s******s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : btw, 这个roche有mix, 酶/buffer/dNTP/biotin-dCTP啥的都混在一起, : 加到DNA里面温浴一下就好了。
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o**4 发帖数: 35028 | 23 那我就从基因组上enhancer的两边多扩增一些出来就行了吧?
比如100bp怎么样?
另外,使用单链DNA做pull down好?还是应该用双链呢?
O(∩_∩)O谢谢
【在 T**********t 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 其实我自己没做过pull down。。。说错了的话,谢绝追杀。 : 如果你知道你的binding motif是什么序列,在它前面加5-10bp的linker一般就够了吧 : 我觉得。不过要先用mfold或者类似的软件看一下你加的linker不会影响到你需要的那 : 个binding motif的二级结构。
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T**********t 发帖数: 1604 | 24 越长未必越好。我觉得还是从短片段开始做起,pull down效果如果不好再用长片段吧。
至于是单链还是双链,得看你打算pull down的蛋白是结合单链还是双链了。
【在 o**4 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 那我就从基因组上enhancer的两边多扩增一些出来就行了吧? : 比如100bp怎么样? : 另外,使用单链DNA做pull down好?还是应该用双链呢? : O(∩_∩)O谢谢
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o**4 发帖数: 35028 | 25 那还是用双链?这个更加接近in vivo吧
“越长未必越好”,怎么说啊?
吧。
【在 T**********t 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 越长未必越好。我觉得还是从短片段开始做起,pull down效果如果不好再用长片段吧。 : 至于是单链还是双链,得看你打算pull down的蛋白是结合单链还是双链了。
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T**********t 发帖数: 1604 | 26 你不是要pull down跟那个enhancer特异结合的蛋白么?你的oligo越长,结构就越复杂
,最后pull down下来一堆别的东西怎么办?
【在 o**4 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 那还是用双链?这个更加接近in vivo吧 : “越长未必越好”,怎么说啊? : : 吧。
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o**4 发帖数: 35028 | 27 做mutant啊,
【在 T**********t 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 你不是要pull down跟那个enhancer特异结合的蛋白么?你的oligo越长,结构就越复杂 : ,最后pull down下来一堆别的东西怎么办?
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T**********t 发帖数: 1604 | 28 哦。
那短片段也可以做Mutant啊。短片段可以直接合成,不是容易点么。你要直接上100bp
的也没啥就是了。我说过我没做过pull down,所以就是纸上谈兵而已。
【在 o**4 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 做mutant啊,
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W****C 发帖数: 1937 | 29
不用100吧 越长不是越容易有2级结构。 我做NFKB的 就用20多个
【在 o**4 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 那我就从基因组上enhancer的两边多扩增一些出来就行了吧? : 比如100bp怎么样? : 另外,使用单链DNA做pull down好?还是应该用双链呢? : O(∩_∩)O谢谢
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W****C 发帖数: 1937 | 30
一般都是双链吧 可以直接定双链的, 比较贵, 或者自己定两个互补单链的, 然
后做成双链
【在 o**4 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 那还是用双链?这个更加接近in vivo吧 : “越长未必越好”,怎么说啊? : : 吧。
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o**4 发帖数: 35028 | 31 能拉下多少蛋白?
【在 W****C 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : : 一般都是双链吧 可以直接定双链的, 比较贵, 或者自己定两个互补单链的, 然 : 后做成双链
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o**4 发帖数: 35028 | 32 好的,
请问你用的protoco是啥 啊?
你在哪个公司定的biotin的引物啊?
能拉下超过20种的蛋白么?
除了western检测外,能不能用MS?
【在 W****C 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : : 一般都是双链吧 可以直接定双链的, 比较贵, 或者自己定两个互补单链的, 然 : 后做成双链
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