n***g
发帖数: 5027 | 1 本人没有这方面的经验，有没有好的建议和protocol呢？
比如，DNA大小？
O(∩_∩)O谢谢 |
n***g
发帖数: 5027 | |
s****l
发帖数: 395 | 3 primer合成时加biotin，一般可以到80nt，DNA大小限制应该不大，几kb应该都能
pulldown下来的
【在 n***g 的大作中提到】
: 本人没有这方面的经验，有没有好的建议和protocol呢？
: 比如，DNA大小？
: O(∩_∩)O谢谢
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s******s
发帖数: 13035 | 4 没看懂。你想用啥pull啥？用DNA probe去pull其他东西？
【在 n***g 的大作中提到】
: 本人没有这方面的经验，有没有好的建议和protocol呢？
: 比如，DNA大小？
: O(∩_∩)O谢谢
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o**4
发帖数: 35028 | 5 20bp的DNA可以么？
【在 s****l 的大作中提到】
: primer合成时加biotin，一般可以到80nt，DNA大小限制应该不大，几kb应该都能
: pulldown下来的
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o**4
发帖数: 35028 | 6 用DNA可以pull down 跟它结合的蛋白质么？
【在 s******s 的大作中提到】
: 没看懂。你想用啥pull啥？用DNA probe去pull其他东西？
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T**********t
发帖数: 1604 | 7 就像3楼所说，biotin可以在合成引物的时候直接label在5'端。正常的引物长度都可以
，也不贵。需要更长的片段可以用label好的引物去跑个PCR，和普通PCR的条件是一样
的。跑完PCR之后，用streptavidin beads可以直接把带biotin label的片段和其他片
段分开。 |
s******s
发帖数: 13035 | 8 当然啦
【在 o**4 的大作中提到】
: 用DNA可以pull down 跟它结合的蛋白质么？
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s******s
发帖数: 13035 | 9 你到底是用DNA pull啥？只要DNA，多长都可以，不过毫无意义。
要pull蛋白，20bp估计太小了吧？要pull其他的DNA，20bp不够
牢，一般用LNA,PNA一类的
【在 o**4 的大作中提到】
: 20bp的DNA可以么？
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s******s
发帖数: 13035 | 10 一般比较段的就用引物了，比较长的，尤其要求结合比较牢的，可以
nick translation
【在 T**********t 的大作中提到】
: 就像3楼所说，biotin可以在合成引物的时候直接label在5'端。正常的引物长度都可以
: ，也不贵。需要更长的片段可以用label好的引物去跑个PCR，和普通PCR的条件是一样
: 的。跑完PCR之后，用streptavidin beads可以直接把带biotin label的片段和其他片
: 段分开。
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o**4
发帖数: 35028 | 11 O(∩_∩)O谢谢，就是不知道用多长的DNA做pull down合适。 20bp是不是太小了？
【在 T**********t 的大作中提到】
: 就像3楼所说，biotin可以在合成引物的时候直接label在5'端。正常的引物长度都可以
: ，也不贵。需要更长的片段可以用label好的引物去跑个PCR，和普通PCR的条件是一样
: 的。跑完PCR之后，用streptavidin beads可以直接把带biotin label的片段和其他片
: 段分开。
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o**4
发帖数: 35028 | 12 用DNA pull蛋白质
【在 s******s 的大作中提到】
: 你到底是用DNA pull啥？只要DNA，多长都可以，不过毫无意义。
: 要pull蛋白，20bp估计太小了吧？要pull其他的DNA，20bp不够
: 牢，一般用LNA,PNA一类的
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o**4
发帖数: 35028 | 13
~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~这个怎么做啊？引物最长能合成多长啊？
【在 s******s 的大作中提到】
: 一般比较段的就用引物了，比较长的，尤其要求结合比较牢的，可以
: nick translation
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W****C
发帖数: 1937 | 14
20bp不小 很多都是用这么大的 完全可以包括ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ
【在 s******s 的大作中提到】
: 你到底是用DNA pull啥？只要DNA，多长都可以，不过毫无意义。
: 要pull蛋白，20bp估计太小了吧？要pull其他的DNA，20bp不够
: 牢，一般用LNA,PNA一类的
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o**4
发帖数: 35028 | 15 能不能帮忙弄到一篇参考文献啊？
O(∩_∩)O谢谢
【在 W****C 的大作中提到】
:
: 20bp不小 很多都是用这么大的 完全可以包括ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ
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T**********t
发帖数: 1604 | 16 你和nanog是分身啊？
Analysis of Protein-DNA Binding by Streptavidin-Agarose Pulldown
Kenneth K. Wu
Gene Mapping, Discovery, and Expression
Methods in Molecular Biology, 2006, Volume 338, 281-290, DOI: 10.1385/1-
59745-097-9:281
http://www.springerlink.com/content/j274505582u54474/fulltext.p
【在 o**4 的大作中提到】
: 能不能帮忙弄到一篇参考文献啊？
: O(∩_∩)O谢谢
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o**4
发帖数: 35028 | 17 太感谢了啊，
我这有个enhancer，只有20bp，
你说我是用这个20bp去拉蛋白呢？还是用更长的DNA去拉蛋白比较好呢？
另外，多长最合适呢？
O(∩_∩)O谢谢
【在 T**********t 的大作中提到】
: 你和nanog是分身啊？
: Analysis of Protein-DNA Binding by Streptavidin-Agarose Pulldown
: Kenneth K. Wu
: Gene Mapping, Discovery, and Expression
: Methods in Molecular Biology, 2006, Volume 338, 281-290, DOI: 10.1385/1-
: 59745-097-9:281
: http://www.springerlink.com/content/j274505582u54474/fulltext.p
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s******s
发帖数: 13035 | 18 要有六七个bp浪费在linker上吧
【在 W****C 的大作中提到】
:
: 20bp不小 很多都是用这么大的 完全可以包括ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ
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s******s
发帖数: 13035 | 19 这个是长的probe，普通的PCR产物或者plasmid, 用DNaseI随机切出nick,
然后用klenow还是啥重新合成片段掺入biotin。长度大概200bp－500bp，
取决于反应时间，时间越长，DNaseI的nick越多，片段越短
【在 o**4 的大作中提到】
: 太感谢了啊，
: 我这有个enhancer，只有20bp，
: 你说我是用这个20bp去拉蛋白呢？还是用更长的DNA去拉蛋白比较好呢？
: 另外，多长最合适呢？
: O(∩_∩)O谢谢
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s******s
发帖数: 13035 | 20 btw, 这个roche有mix, 酶/buffer/dNTP/biotin-dCTP啥的都混在一起，
加到DNA里面温浴一下就好了。
【在 s******s 的大作中提到】
: 这个是长的probe，普通的PCR产物或者plasmid, 用DNaseI随机切出nick,
: 然后用klenow还是啥重新合成片段掺入biotin。长度大概200bp－500bp，
: 取决于反应时间，时间越长，DNaseI的nick越多，片段越短
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T**********t
发帖数: 1604 | 21 其实我自己没做过pull down。。。说错了的话，谢绝追杀。
如果你知道你的binding motif是什么序列，在它前面加5-10bp的linker一般就够了吧
我觉得。不过要先用mfold或者类似的软件看一下你加的linker不会影响到你需要的那
个binding motif的二级结构。
【在 o**4 的大作中提到】
: 太感谢了啊，
: 我这有个enhancer，只有20bp，
: 你说我是用这个20bp去拉蛋白呢？还是用更长的DNA去拉蛋白比较好呢？
: 另外，多长最合适呢？
: O(∩_∩)O谢谢
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o**4
发帖数: 35028 | 22 哦，这个挺好的，也许我要用到
【在 s******s 的大作中提到】
: btw, 这个roche有mix, 酶/buffer/dNTP/biotin-dCTP啥的都混在一起，
: 加到DNA里面温浴一下就好了。
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o**4
发帖数: 35028 | 23 那我就从基因组上enhancer的两边多扩增一些出来就行了吧？
比如100bp怎么样？
另外，使用单链DNA做pull down好？还是应该用双链呢？
O(∩_∩)O谢谢
【在 T**********t 的大作中提到】
: 其实我自己没做过pull down。。。说错了的话，谢绝追杀。
: 如果你知道你的binding motif是什么序列，在它前面加5-10bp的linker一般就够了吧
: 我觉得。不过要先用mfold或者类似的软件看一下你加的linker不会影响到你需要的那
: 个binding motif的二级结构。
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T**********t
发帖数: 1604 | 24 越长未必越好。我觉得还是从短片段开始做起，pull down效果如果不好再用长片段吧。
至于是单链还是双链，得看你打算pull down的蛋白是结合单链还是双链了。
【在 o**4 的大作中提到】
: 那我就从基因组上enhancer的两边多扩增一些出来就行了吧？
: 比如100bp怎么样？
: 另外，使用单链DNA做pull down好？还是应该用双链呢？
: O(∩_∩)O谢谢
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o**4
发帖数: 35028 | 25 那还是用双链？这个更加接近in vivo吧
“越长未必越好”，怎么说啊？
吧。
【在 T**********t 的大作中提到】
: 越长未必越好。我觉得还是从短片段开始做起，pull down效果如果不好再用长片段吧。
: 至于是单链还是双链，得看你打算pull down的蛋白是结合单链还是双链了。
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T**********t
发帖数: 1604 | 26 你不是要pull down跟那个enhancer特异结合的蛋白么？你的oligo越长，结构就越复杂
，最后pull down下来一堆别的东西怎么办？
【在 o**4 的大作中提到】
: 那还是用双链？这个更加接近in vivo吧
: “越长未必越好”，怎么说啊？
:
: 吧。
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o**4
发帖数: 35028 | 27 做mutant啊，
【在 T**********t 的大作中提到】
: 你不是要pull down跟那个enhancer特异结合的蛋白么？你的oligo越长，结构就越复杂
: ，最后pull down下来一堆别的东西怎么办？
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T**********t
发帖数: 1604 | 28 哦。
那短片段也可以做Mutant啊。短片段可以直接合成，不是容易点么。你要直接上100bp
的也没啥就是了。我说过我没做过pull down，所以就是纸上谈兵而已。
【在 o**4 的大作中提到】
: 做mutant啊，
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W****C
发帖数: 1937 | 29
不用１００吧 越长不是越容易有２级结构。 我做ＮＦＫＢ的 就用２０多个
【在 o**4 的大作中提到】
: 那我就从基因组上enhancer的两边多扩增一些出来就行了吧？
: 比如100bp怎么样？
: 另外，使用单链DNA做pull down好？还是应该用双链呢？
: O(∩_∩)O谢谢
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W****C
发帖数: 1937 | 30
一般都是双链吧 可以直接定双链的， 比较贵， 或者自己定两个互补单链的， 然
后做成双链
【在 o**4 的大作中提到】
: 那还是用双链？这个更加接近in vivo吧
: “越长未必越好”，怎么说啊？
:
: 吧。
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o**4
发帖数: 35028 | 31 能拉下多少蛋白？
【在 W****C 的大作中提到】
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: 一般都是双链吧 可以直接定双链的， 比较贵， 或者自己定两个互补单链的， 然
: 后做成双链
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o**4
发帖数: 35028 | 32 好的，
请问你用的protoco是啥 啊？
你在哪个公司定的biotin的引物啊？
能拉下超过20种的蛋白么？
除了western检测外，能不能用MS？
【在 W****C 的大作中提到】
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: 一般都是双链吧 可以直接定双链的， 比较贵， 或者自己定两个互补单链的， 然
: 后做成双链
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