g*****y
发帖数: 6325 | 1 我的蛋白bl21(DE3)的细胞里0.5mM IPTG induction 表达很好。后来转到BL21(DE3
pLysS)里 加IPTG却不表达我试过
0.1-2mM的IPTG. 2hr, 4hr 和 o/n. 2mM IPTG O/N 好像有一点点表达。。 都是同样
的蛋白同样的hosting vector. 现
在怀疑是不是BL21(DE3 pLysS)里表达的lysozyme 把我的蛋白降解了? 不太可能啊！
大家有没有遇到类似的情况呢？ |
b********c
发帖数: 161 | 2 我老板说他以前也遇到过这种情况,就是完全不表达了,原因不详,所以我们就没有继续
用plys的了. |
T**********t
发帖数: 1604 | 3 我就是用的BL21(DE3)pLysS strain，用0.4mM的IPTG诱导，表达4hr，蛋白产量很好。
T7 lysozyme是T7 RNA polymerase的natural inhibitor，它的表达是为了抑制在BL21(
DE3)里比较常见的leaky expression，但是这个表达量不至于抑制被IPTG诱导后的
expression。而且lysozyme不是蛋白酶，不可能降解你的蛋白。
你的蛋白如果用BL21(DE3)表达很好，说明你的蛋白对E.coli没有细胞毒性，你可以不
需要用BL21(DE3)pLysS来表达。
还有就是你看一下你用的是BL21系列还是BL21 Gold系列，这两个系列都有(DE3)和(DE3
)pLysS，但是我用BL21 Gold系列就碰到过表达不出来的问题。我说的BL21和BL21 Gold
都是Stratagene（现在的Agilent Genomics）的产品，不知道别的公司是不是也是这么
标识的。 |
s********n
发帖数: 2939 | 4 既然在BL21(DE3)表达很好的话，为什么还要试BL21(DE3)pLysS呢？有特殊原因？我的
经验是BL21(DE3)pLysS表达很多蛋白都不好。 |
g*****y
发帖数: 6325 | 5 是的lysozyme 降解多糖的。。 不应该降解我的蛋白。 我表达好的是bl21 gold. 但是
我最后是必须用plysS这个菌株的因
为这个菌株是从别的实验室拿来的还有另一个特别的属性是我需要的。 我现在想在没
有chlor resist 的LB培养这个菌株一
段时间直到它失去plysS这个vector. 不知道可行吗?
BL21(
DE3
Gold
【在 T**********t 的大作中提到】
: 我就是用的BL21(DE3)pLysS strain，用0.4mM的IPTG诱导，表达4hr，蛋白产量很好。
: T7 lysozyme是T7 RNA polymerase的natural inhibitor，它的表达是为了抑制在BL21(
: DE3)里比较常见的leaky expression，但是这个表达量不至于抑制被IPTG诱导后的
: expression。而且lysozyme不是蛋白酶，不可能降解你的蛋白。
: 你的蛋白如果用BL21(DE3)表达很好，说明你的蛋白对E.coli没有细胞毒性，你可以不
: 需要用BL21(DE3)pLysS来表达。
: 还有就是你看一下你用的是BL21系列还是BL21 Gold系列，这两个系列都有(DE3)和(DE3
: )pLysS，但是我用BL21 Gold系列就碰到过表达不出来的问题。我说的BL21和BL21 Gold
: 都是Stratagene（现在的Agilent Genomics）的产品，不知道别的公司是不是也是这么
: 标识的。
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g*****y
发帖数: 6325 | 6 我最后是必须用plysS这个菌株的因
为这个菌株是从别的实验室拿来的还有另一个特别的属性是我需要的
【在 s********n 的大作中提到】
: 既然在BL21(DE3)表达很好的话，为什么还要试BL21(DE3)pLysS呢？有特殊原因？我的
: 经验是BL21(DE3)pLysS表达很多蛋白都不好。
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k*****o
发帖数: 1486 | |
s******s
发帖数: 13035 | 8 多试几个克隆？
【在 g*****y 的大作中提到】
: 我的蛋白bl21(DE3)的细胞里0.5mM IPTG induction 表达很好。后来转到BL21(DE3
: pLysS)里 加IPTG却不表达我试过
: 0.1-2mM的IPTG. 2hr, 4hr 和 o/n. 2mM IPTG O/N 好像有一点点表达。。 都是同样
: 的蛋白同样的hosting vector. 现
: 在怀疑是不是BL21(DE3 pLysS)里表达的lysozyme 把我的蛋白降解了? 不太可能啊！
: 大家有没有遇到类似的情况呢？
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g*****y
发帖数: 6325 | 9 至今挑过2个。 都没有表达。。 打算在做一次transformation试试。
【在 s******s 的大作中提到】
: 多试几个克隆？
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n*********m
发帖数: 38 | 10 You can try low Temperature. But I think Cam is necessary for the induction. |
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T**********t
发帖数: 1604 | 11 对，还有一个我忘了说，就是检查一下培养箱温度。
我原先用BL21-Gold的DE3 pLysS表达出现问题troubleshooting的时候，后来发现就是
培养箱温度不对，设定37度，实际到了39度。这时候用BL21的DE3 pLysS表达就没有问
题，但是BL21-Gold的菌液几乎完全被lyse掉了。所以后来虽然我把培养箱温度重新设
定好了，还是不敢再用BL21-Gold的菌株了。
induction.
【在 n*********m 的大作中提到】
: You can try low Temperature. But I think Cam is necessary for the induction.
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n***w
发帖数: 2405 | 12 正在做蛋白表达，用的是rosetta-gami 2 DE3 plyss, 这里各种trouble shooting，我
喜欢～ |
s********n
发帖数: 2939 | 13 你是指你用的这个带有pLysS的菌株是别人engineer过的，不是commercial的？
如果是这样的话他们应该会有原始不带pLysS的菌株，问问看。
如果实在不行的话，可以试试将这个菌株在不含Cm的培养基转接几次，然后划线在不含
Cm的平板，挑取单clone再分别划线于带有Cm和不含Cm的平板，这样估计你能找到丢失
pLysS质粒的菌株。
【在 g*****y 的大作中提到】
: 我最后是必须用plysS这个菌株的因
: 为这个菌株是从别的实验室拿来的还有另一个特别的属性是我需要的
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g*****y
发帖数: 6325 | 14 不是不是， 是他们在novogen买了plysS的细胞然后又加了一种特性。我也是这么想的
。希望不要花太多时间。 还有你知
道那里有卖那种可以把一个板子上的colony复制到另一个板子上的那种film吗？ 我想
用这个方法可能筛选快点。
【在 s********n 的大作中提到】
: 你是指你用的这个带有pLysS的菌株是别人engineer过的，不是commercial的？
: 如果是这样的话他们应该会有原始不带pLysS的菌株，问问看。
: 如果实在不行的话，可以试试将这个菌株在不含Cm的培养基转接几次，然后划线在不含
: Cm的平板，挑取单clone再分别划线于带有Cm和不含Cm的平板，这样估计你能找到丢失
: pLysS质粒的菌株。
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w**t
发帖数: 52 | |
g*****y
发帖数: 6325 | |
h*******0
发帖数: 48 | 17 我觉得很多时候不表达是因为菌种污染了
不是BL21或者菌里没有质粒
只要是含表达载体的BL21，肯定可以通过诱导表达的 |
T**********t
发帖数: 1604 | 18 有一个问题，万一你的蛋白不表达不是因为pLysS，而是因为这个另一个特别的属性呢
？如果是这样，那你就算把pLysS质粒想办法剔除了也还是一样解决不了问题啊。。。
【在 g*****y 的大作中提到】
: 我最后是必须用plysS这个菌株的因
: 为这个菌株是从别的实验室拿来的还有另一个特别的属性是我需要的
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