v***a
发帖数: 1242 | 1 需要某蛋白激酶在我培养的细胞里过量表达，筛选plasmid constructs时测序是正确的
，不过大量培养后得到很多的DNA拿去测序，好像说质量不好，测序结果就没有太较真。
然后就transfect我培养的细胞，取得cell lysate做western blot，发现蛋白表达量对
照vector的control基本无变化。以前我也在相同的细胞里overexpress过一个蛋白，
work得都还好。我应该怎么做，才能用western blot看到蛋白表达量的变化呢？谢谢！ |
m*********n
发帖数: 215 | 2 重新转化，挑单克隆然后测序。如果你的插入序列是pcr来的话，测序需要设计primer
把插入序列的全场都测过。还有你用的细胞系内源表达此担保么？ |
S******e
发帖数: 393 | 3 个人几点想法：
1）confirm constructs 正确
2) 质粒最好纯度要高，至少不要太差
3）转化效率要高
如果蛋白较大，转染后即使有表达（比如检测tag), 但量不够，
这时用内源蛋白抗体检测时就不一定能看到差异,正如你所说的与control比没变化。
如果你的构建加tag了，就检测一下看是否已表达了，若已表达那就想办法提高转化效
率吧。
(另外还想到的是加inducible 的promoter诱导时间长一些，不知是不是可行，仅供参
考） |
v**********m
发帖数: 5516 | 4 现实和理想是有差距的，不是没有恋曲都有美好结局。
你的蛋白可能压根就表达后不稳定或不表达。
真。
【在 v***a 的大作中提到】
: 需要某蛋白激酶在我培养的细胞里过量表达，筛选plasmid constructs时测序是正确的
: ，不过大量培养后得到很多的DNA拿去测序，好像说质量不好，测序结果就没有太较真。
: 然后就transfect我培养的细胞，取得cell lysate做western blot，发现蛋白表达量对
: 照vector的control基本无变化。以前我也在相同的细胞里overexpress过一个蛋白，
: work得都还好。我应该怎么做，才能用western blot看到蛋白表达量的变化呢？谢谢！
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v***a
发帖数: 1242 | 5 昨天重新测序了，全对。不过stop codon “TAA”的最后一个“A”未测出来，这个应
该不要紧吧？我的细胞是primary cells，我把plasmid转染进细胞，进行transient
overexpression。
primer
【在 m*********n 的大作中提到】
: 重新转化，挑单克隆然后测序。如果你的插入序列是pcr来的话，测序需要设计primer
: 把插入序列的全场都测过。还有你用的细胞系内源表达此担保么？
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v***a
发帖数: 1242 | 6 谢谢！
我的蛋白没有tag，就是用抗此蛋白激酶的抗体看表达。这个蛋白本身在basal level下
用抗体看WB都蛮清楚的，看不出来差异会和此有关吗？
重新测序全对（除去终止子最后一个未得到confirm），质粒的纯度还行，A260/A280是
1.746，A260是0.365 AU。
提高转化效率有哪些方法呢？
【在 S******e 的大作中提到】
: 个人几点想法：
: 1）confirm constructs 正确
: 2) 质粒最好纯度要高，至少不要太差
: 3）转化效率要高
: 如果蛋白较大，转染后即使有表达（比如检测tag), 但量不够，
: 这时用内源蛋白抗体检测时就不一定能看到差异,正如你所说的与control比没变化。
: 如果你的构建加tag了，就检测一下看是否已表达了，若已表达那就想办法提高转化效
: 率吧。
: (另外还想到的是加inducible 的promoter诱导时间长一些，不知是不是可行，仅供参
: 考）
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S******e
发帖数: 393 | 7 当时我转的蛋白较大，检测tag可以看到表达，但用蛋白本身抗体检测就看不大出来差
异，说明表达量还不够高。
MCS后一般有stop condon, 所以你的stop condon 没测出来应该没大问题。
我做transfection的质粒一般A260/280 是大于等于1.9， Qiagen kit prep.
plasmid浓度最好1ug/ul 以上。
我觉得你看不到差异的原因很可能是表达量还不够，但你没有tag也没法检测它是否已
表达，你把效率提上去再检测看看，我觉得还是很有希望。
提高转化效率也是我一直的问题，但我估计我转的质粒比你大，我前几天在这问过这个
问题。 你先用脂质体方法试两次，LTX或lip2000, 若还不行，建议你再try电转，据说
效率高出很多。
【在 v***a 的大作中提到】
: 谢谢！
: 我的蛋白没有tag，就是用抗此蛋白激酶的抗体看表达。这个蛋白本身在basal level下
: 用抗体看WB都蛮清楚的，看不出来差异会和此有关吗？
: 重新测序全对（除去终止子最后一个未得到confirm），质粒的纯度还行，A260/A280是
: 1.746，A260是0.365 AU。
: 提高转化效率有哪些方法呢？
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S******e
发帖数: 393 | 8 另外，如果你的基因不是特别大，改用lentivirus，也是一个不错的选择。 |
K*o
发帖数: 96 | 9 有可能是降解太快了，你下次做Transfection的时候，多做一个孔，然后在收细胞前6
个小时加MG132。看看如果抑制降解这个蛋白是不是就能在Western上看到了。
我自己就曾经遇到一摸一样的问题，troubleshooting这个那个的，白费了我好大功夫
。 |
v***a
发帖数: 1242 | 10 真是非常感谢！可以问一下，MG132的工作浓度你大概用怎么一个范围？那以后做超量
表达的时候是不是都要以MG132的treatment作为基础了？如果对其它因素有影响，怎么
来区分是不是因为使用了MG132的缘故呢？
6
【在 K*o 的大作中提到】
: 有可能是降解太快了，你下次做Transfection的时候，多做一个孔，然后在收细胞前6
: 个小时加MG132。看看如果抑制降解这个蛋白是不是就能在Western上看到了。
: 我自己就曾经遇到一摸一样的问题，troubleshooting这个那个的，白费了我好大功夫
: 。
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K*o
发帖数: 96 | 11 我一般用的是10mM. 只能用几个小时，过夜的话，细胞就都全死光了。
所以不能在试验的时候加MG132.不过如果你发现确实是因为蛋白降解太快导致的话，只
能Mutate关键位点，让它变稳定些。 |
