e***o
发帖数: 344 | 1 我的PCR片段有850bp（650-950）左右，加上p5,p7，adapter的话就快到1k了。我只需
用pair-end测两端各35bp就够了。1k的大小应该不会太影响通量。就是不知道1kb在芯
片上扩增的时候是否效率会很低。到时荧光强度会受影响。
不知道有哪位大侠有过类似的经验。谢谢。 |
G***y
发帖数: 1082 | 2 It should work, you probably want to reduce the cluster density to make sure
they are separate. |
p*********e
发帖数: 33 | 3 常规的GA II X 或Hiseq 很难测大于500bp的片段，这个是硬件的原因。如果片段太大
，Read1 和Read2出错配的可能性也就大大增加（如果你用dual barcode adapter,很容
易鉴别出来。）
目前Miseq II 可以测250x2 的Pair-end。你可以尝试在Miseq上测序一下（又便宜又快
),如果可能的话建议用dual barcode adapter。
还有，片段太大的话，cluster generation时延伸的时间也要适当的增加。
【在 e***o 的大作中提到】
: 我的PCR片段有850bp（650-950）左右，加上p5,p7，adapter的话就快到1k了。我只需
: 用pair-end测两端各35bp就够了。1k的大小应该不会太影响通量。就是不知道1kb在芯
: 片上扩增的时候是否效率会很低。到时荧光强度会受影响。
: 不知道有哪位大侠有过类似的经验。谢谢。
|
l**********1
发帖数: 5204 | 4 楼主 还是考虑用 牛津的Nanopore 吧
同主题阅读：测序技术的重磅炸弹--Oxford Nanopore
[版面:生物学][首篇作者：Farland] , 2012年02月17日
HTTP : //www.mitbbs.com/article_t/Biology/31636519.html
【在 p*********e 的大作中提到】
: 常规的GA II X 或Hiseq 很难测大于500bp的片段，这个是硬件的原因。如果片段太大
: ，Read1 和Read2出错配的可能性也就大大增加（如果你用dual barcode adapter,很容
: 易鉴别出来。）
: 目前Miseq II 可以测250x2 的Pair-end。你可以尝试在Miseq上测序一下（又便宜又快
: ),如果可能的话建议用dual barcode adapter。
: 还有，片段太大的话，cluster generation时延伸的时间也要适当的增加。
|
t*d
发帖数: 1290 | 5 lz 说的是library 的长度，不是read 的长度。read 的长度lz只要求 35bp好不好。 |
s******9
发帖数: 283 | 6 1000bp template might turn into some clusters of weird shapes that cannot
pass the filter. |
e***o
发帖数: 344 | 7 谢谢各位的回复。我主要的担心在cluster时候的反应效率过低造成信
号过弱。
我的理解是密度应该不是大的问题，可能不会相互干扰。初步打算先混一点在别的样品
里试试。
synbio79所说的weird cluster是指的什么。是不是相互干扰还是柔性太大干扰测序或
不能形成有效的cluster？ |
s******9
发帖数: 283 | 8 In principal, long template should affect the cluster density. Weird
clusters mean non-circular ones. Standard clusters usually have a round
shape.
Somebody told me 1000bp worked for him, which tells the robustness of this
amplification method. But I guess 1000bp can compromise your data quality.
【在 e***o 的大作中提到】
: 谢谢各位的回复。我主要的担心在cluster时候的反应效率过低造成信
: 号过弱。
: 我的理解是密度应该不是大的问题，可能不会相互干扰。初步打算先混一点在别的样品
: 里试试。
: synbio79所说的weird cluster是指的什么。是不是相互干扰还是柔性太大干扰测序或
: 不能形成有效的cluster？
|
a*******9
发帖数: 75 | 9 MiSEQ Amplicon sequencing is perfect for this kind of projects. You can
contact me for more detail information. |
s********n
发帖数: 2939 | 10 成品都没影呢，还说用？
【在 l**********1 的大作中提到】
: 楼主 还是考虑用 牛津的Nanopore 吧
: 同主题阅读：测序技术的重磅炸弹--Oxford Nanopore
: [版面:生物学][首篇作者：Farland] , 2012年02月17日
: HTTP : //www.mitbbs.com/article_t/Biology/31636519.html
|
|
|
l**********1
发帖数: 5204 | 11 >
DNA prefers to dive head first into nanopores
January 8, 2013
by Kevin Stacey Enlarge
When a DNA strand is captured and pulled through a nanopore,
it's much more likely to start the journey at one of its ends (top left)
rather than being grabbed somewhere in the middle and pulled through in a
folded configuration. Credit: Stein lab/Brown University (Phys.org)—In the
1960s, Nobel laureate Pierre-Gilles de Gennes postulated that someday
researchers could test his theories of polymer networks by observing single
molecules. Researchers at Brown observed single molecules of DNA being drawn
through nanopores by electrical current and figured out why they most often
travel head first.
Journal reference:
Physical Review Letters
Provided by Brown University
HTTP: //phys.org/news/2013-01-dna-nanopores.html
【在 s********n 的大作中提到】
: 成品都没影呢，还说用？
|
s********n
发帖数: 2939 | 12 成品被检验之前都是虚的，ONT吹了也跳票了快一年了吧，感觉是遇到了关键性的技术
问题还没能解决，拭目以待吧
the
single
【在 l**********1 的大作中提到】
: >
: DNA prefers to dive head first into nanopores
: January 8, 2013
: by Kevin Stacey Enlarge
: When a DNA strand is captured and pulled through a nanopore,
: it's much more likely to start the journey at one of its ends (top left)
: rather than being grabbed somewhere in the middle and pulled through in a
: folded configuration. Credit: Stein lab/Brown University (Phys.org)—In the
: 1960s, Nobel laureate Pierre-Gilles de Gennes postulated that someday
: researchers could test his theories of polymer networks by observing single
|
f*******2
发帖数: 14 | 13 What is the throughput you are looking for? If you only need about 30 to 50k
reads, Pacbio RS might also work for you. It can sequence the whole 1kb
amplicon with Sanger accuracy. Let me know if you need more info.
【在 e***o 的大作中提到】
: 我的PCR片段有850bp（650-950）左右，加上p5,p7，adapter的话就快到1k了。我只需
: 用pair-end测两端各35bp就够了。1k的大小应该不会太影响通量。就是不知道1kb在芯
: 片上扩增的时候是否效率会很低。到时荧光强度会受影响。
: 不知道有哪位大侠有过类似的经验。谢谢。
|
e***o
发帖数: 344 | 14 thanks a lot! My email is l******[email protected] Ilook forward to hearing from
you.
50k
【在 f*******2 的大作中提到】
: What is the throughput you are looking for? If you only need about 30 to 50k
: reads, Pacbio RS might also work for you. It can sequence the whole 1kb
: amplicon with Sanger accuracy. Let me know if you need more info.
|
l**********1
发帖数: 5204 | 15 >Pacific Biosciences (PacBio) RS, the first TGS platform to offer very long
reads, has an average read length of 2–3 kb
cited from by PacBio one new paper,
pls check,
Au KF at al., (2013).
Characterization of the human ESC transcriptome by hybrid sequencing.
Proc Natl Acad Sci U S A. 110: E4821-30.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24282307
【在 e***o 的大作中提到】
: thanks a lot! My email is l******[email protected] Ilook forward to hearing from
: you.
:
: 50k
|
