p*******r
发帖数: 59 | 1 想用 CRISPR knockout human cell line的基因, 有必要用 knicking cas9吗?
Cutting cas9 的off-target 可能性大吗？
293T细胞如果有９０％的transfection efficiency for plasmids, 如果不筛选的话有
多少细胞的基因最后会被knockout呢? 能不能不做drug selection or GFP FACS, 就做
一下预实验看看基因作用？像siRNA一样用?
有必要用Lentivirus吗? Lentivirus是不是主要在做难转化的细胞的时候用的？
Thanks! |
t**l
发帖数: 109 | 2 看你的实验目的了，如果你的实验结果是在293T上做，phenotype可以快速的看到，可
以不做筛选。但是这样的phenotype并不是KO.我觉得如果想快速的看看是否有作用，可
以。但是早晚还是要pick single cell clone. 来验证。要不是CRISPR这个技术就浪费
了。除非你是做screen. |
s******s
发帖数: 13035 | 3 我道听途说，只要能转进去，据说knockout接近100%
我不负责是否正确
【在 p*******r 的大作中提到】
: 想用 CRISPR knockout human cell line的基因, 有必要用 knicking cas9吗?
: Cutting cas9 的off-target 可能性大吗？
: 293T细胞如果有９０％的transfection efficiency for plasmids, 如果不筛选的话有
: 多少细胞的基因最后会被knockout呢? 能不能不做drug selection or GFP FACS, 就做
: 一下预实验看看基因作用？像siRNA一样用?
: 有必要用Lentivirus吗? Lentivirus是不是主要在做难转化的细胞的时候用的？
: Thanks!
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a***y
发帖数: 19743 | 4 感觉不错，可以考虑设计使用crispr或talen的实验…
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7
【在 s******s 的大作中提到】
: 我道听途说，只要能转进去，据说knockout接近100%
: 我不负责是否正确
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D***a
发帖数: 516 | 5 是不是现在有了CRISPR，还在用shRNA就已经过时了？比如我想干扰掉wild type， 再
过表达mutant。没有CRISPR以前，这样做的文章还不少。 |
a*****n
发帖数: 2835 | 6 CRISPR很有用，但是感觉还没有能够取代RNAi
【在 D***a 的大作中提到】
: 是不是现在有了CRISPR，还在用shRNA就已经过时了？比如我想干扰掉wild type， 再
: 过表达mutant。没有CRISPR以前，这样做的文章还不少。
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s******s
发帖数: 13035 | 7 两回事。crisper可以做homozygous mutant，也就是knockout；
RNAi这玩意儿更像hetreozygous mutation，knockdown
【在 a*****n 的大作中提到】
: CRISPR很有用，但是感觉还没有能够取代RNAi
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j****x
发帖数: 1704 | 8 尽管是两回事，但假如crisper做knockout能和RNAi做knockdown一样容易，那么的确可
以预计前者将会取代后者吧
【在 s******s 的大作中提到】
: 两回事。crisper可以做homozygous mutant，也就是knockout；
: RNAi这玩意儿更像hetreozygous mutation，knockdown
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s******s
发帖数: 13035 | 9 非也非也。要看实际情况是啥，你这个是基础科研思路，只要knockout就
最好。实际上，很多疾病并不是knockout的，而是dosage造成的问题，有
可能更加接近RNAi。
应该可以1:1混合正常crisper：不切crisper造成hetero解决部分问题，
不过RNAi也可以装到inducible上做更加精细的表达调控，所以我觉得
很多情况下RNAi还是有特有的优势的
【在 j****x 的大作中提到】
: 尽管是两回事，但假如crisper做knockout能和RNAi做knockdown一样容易，那么的确可
: 以预计前者将会取代后者吧
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Z**********g
发帖数: 222 | 10 RNAi也有优点：可以inducible/reversible.
【在 j****x 的大作中提到】
: 尽管是两回事，但假如crisper做knockout能和RNAi做knockdown一样容易，那么的确可
: 以预计前者将会取代后者吧
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z********8
发帖数: 818 | 11
有没有文献支持这个？
【在 s******s 的大作中提到】
: 我道听途说，只要能转进去，据说knockout接近100%
: 我不负责是否正确
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j****x
发帖数: 1704 | 12 除非你要在你的模型上完全mimic不同dosage所造成的不同表型，否则我确实不认为
knockdown在这里相比knockout有什么更多的好处，何况你说的这个情况，也可以用
knockout+knockin来更好的实现。当然，我所说的前提目前不存在，所以也就无所谓取
代RNAi了
【在 s******s 的大作中提到】
: 非也非也。要看实际情况是啥，你这个是基础科研思路，只要knockout就
: 最好。实际上，很多疾病并不是knockout的，而是dosage造成的问题，有
: 可能更加接近RNAi。
: 应该可以1:1混合正常crisper：不切crisper造成hetero解决部分问题，
: 不过RNAi也可以装到inducible上做更加精细的表达调控，所以我觉得
: 很多情况下RNAi还是有特有的优势的
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p*******r
发帖数: 59 | 13 谢谢大家的热情讨论，从Addgene订了Feng Zhang lab的 pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)
和 pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459)plasmids. 打算先用最简单的 transfection 和
cutting cas9 看看结果怎么样. 不行得话再用nicking cas9 and lentivirus.
Welcome more discussions in the future. |
a***y
发帖数: 19743 | 14 本不需要做类似的东西
不过最近考虑下游实验可能需要做overexpression 的knock-in
这个技术也是适用的，对吧？
PX458)
【在 p*******r 的大作中提到】
: 谢谢大家的热情讨论，从Addgene订了Feng Zhang lab的 pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)
: 和 pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459)plasmids. 打算先用最简单的 transfection 和
: cutting cas9 看看结果怎么样. 不行得话再用nicking cas9 and lentivirus.
: Welcome more discussions in the future.
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z*t
发帖数: 863 | 15 我们用32D细胞做indel，电转，addgene上的P458/459都试过。
电转效率比较低，2-3% GFP+,筛出single cell colony,里面8~9/10都有indel，不过
indel是相当heterogenous,几乎没有一样的。
puro因为电转效率太低，没有长起来。
【在 p*******r 的大作中提到】
: 想用 CRISPR knockout human cell line的基因, 有必要用 knicking cas9吗?
: Cutting cas9 的off-target 可能性大吗？
: 293T细胞如果有９０％的transfection efficiency for plasmids, 如果不筛选的话有
: 多少细胞的基因最后会被knockout呢? 能不能不做drug selection or GFP FACS, 就做
: 一下预实验看看基因作用？像siRNA一样用?
: 有必要用Lentivirus吗? Lentivirus是不是主要在做难转化的细胞的时候用的？
: Thanks!
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