r******k
发帖数: 446 | 1 MG132 可以inhibit proteasome degradation， cycloheximide是inhibit denovo
protein synthesis。
看了一些paper都是用这俩药，但是具体意义是什么呢？研究一个protein的half life
有啥意义？
MG132 还可以induce 一些蛋白的nuclear translocation，why？ |
s******y
发帖数: 28562 | 2
life
意思非常大。
举一个例子，很多调节细胞周期的信号蛋白都是短寿命的蛋白，这样可以保证他们在做
完他们的工作之后即使降解被清除掉。如果这个过程受到干扰，弄不好会致癌。
很多种不同的原因，比方说因为一些该降解的废品蛋白没有被降解，导致细胞内出现
misfolding stress.
还有一种原因是Ubiquitylated 的蛋白会改变他们的细胞内定位。
【在 r******k 的大作中提到】
: MG132 可以inhibit proteasome degradation， cycloheximide是inhibit denovo
: protein synthesis。
: 看了一些paper都是用这俩药，但是具体意义是什么呢？研究一个protein的half life
: 有啥意义？
: MG132 还可以induce 一些蛋白的nuclear translocation，why？
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T*****e
发帖数: 247 | 3 cycloheximide是inhibit denovo protein synthesis。
举个例子吧，比如你发现一个细胞事件很有趣、很重要。你想知道它是怎么被调控的。
那么有很多种可能，比如转录，转录后调控，翻译，翻译后调控。翻译后调控又分为很
多种，比如磷酸化修饰，translocation等等。那么怎么把目标范围缩小呢？早期的实
验方法，比如加转录抑制剂看看该细胞事件是否还发生，或者你说的这个加翻译抑制剂
，看看是否需要新的蛋白合成。比如学习记忆的机制里面，短期记忆有的需要蛋白合成
，你可以通过加蛋白合成抑制剂阻断动物的短期记忆来证明这点。而长期记忆还需要转
录的过程，那么你可以通过加转录抑制剂抑制长期记忆来证明。
研究一个protein的half life有啥意义？
我举第二个例子来说明这个。比如说现在很流行的用GFP这样的reporter来研究转录。
具体就是用一个增强子/启动子来驱动GFP表达。那比如说我有一个转录抑制子，我推测
它可以抑制上面提到的GFP的转录。那我把抑制子加到细胞里面去，等了24小时也没看
到什么变化，这能说明这个转录抑制子无效吗？未必。因为GFP的寿命超过24小时。那
么你设计这个实验的时候就应该考虑用一个half life更短的reporter来研究。 |
r******k
发帖数: 446 | 4 非常感谢。 我想研究一个蛋白的WT和mutant之间是否有behave differently。
加MG132 或者CHX， 亦或者两个都加 又能有什么意义呢？
【在 T*****e 的大作中提到】
: cycloheximide是inhibit denovo protein synthesis。
: 举个例子吧，比如你发现一个细胞事件很有趣、很重要。你想知道它是怎么被调控的。
: 那么有很多种可能，比如转录，转录后调控，翻译，翻译后调控。翻译后调控又分为很
: 多种，比如磷酸化修饰，translocation等等。那么怎么把目标范围缩小呢？早期的实
: 验方法，比如加转录抑制剂看看该细胞事件是否还发生，或者你说的这个加翻译抑制剂
: ，看看是否需要新的蛋白合成。比如学习记忆的机制里面，短期记忆有的需要蛋白合成
: ，你可以通过加蛋白合成抑制剂阻断动物的短期记忆来证明这点。而长期记忆还需要转
: 录的过程，那么你可以通过加转录抑制剂抑制长期记忆来证明。
: 研究一个protein的half life有啥意义？
: 我举第二个例子来说明这个。比如说现在很流行的用GFP这样的reporter来研究转录。
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r******k
发帖数: 446 | 5 请问这两种药一起加， 有什么意义呢？
【在 s******y 的大作中提到】
:
: life
: 意思非常大。
: 举一个例子，很多调节细胞周期的信号蛋白都是短寿命的蛋白，这样可以保证他们在做
: 完他们的工作之后即使降解被清除掉。如果这个过程受到干扰，弄不好会致癌。
: 很多种不同的原因，比方说因为一些该降解的废品蛋白没有被降解，导致细胞内出现
: misfolding stress.
: 还有一种原因是Ubiquitylated 的蛋白会改变他们的细胞内定位。
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c**i
发帖数: 265 | 6 那就是可以分析某个时刻的蛋白量，既不能合成，也不能降解。 |
c******g
发帖数: 83 | 7 CHX是用于研究蛋白HALF LIFE的，因为只有抑制了新蛋白的合成，才能准确知道一个蛋
白的寿命，这个一般是要做TIME COURSE. 对于你的试验，你可以用这个方法检测一下
你的WT 和MUT是不是有不同的HALF LIFE。
MG132只适应于能被PROTEASOME降解的蛋白，如果你的蛋白是，加了之后，你会发现蛋
白量增加。这个药有细胞毒性，一般不能超过6小时。如果你的蛋白的HALF LIFE 很长
，那就看不到steady state level 的区别了。这个时候，需要同时加CHX，做TIME
COURSE，观察蛋白的half life是否被延长。 |
r******k
发帖数: 446 | 8 非常感谢呀！ ！！ 但是加MG132 是不是必须是endoegous promoter 才有意义？ 如果
是transient expression我的两个蛋白的话 是不能用MG132研究他们的degradation的
对吧？
再次感谢！！
【在 c******g 的大作中提到】
: CHX是用于研究蛋白HALF LIFE的，因为只有抑制了新蛋白的合成，才能准确知道一个蛋
: 白的寿命，这个一般是要做TIME COURSE. 对于你的试验，你可以用这个方法检测一下
: 你的WT 和MUT是不是有不同的HALF LIFE。
: MG132只适应于能被PROTEASOME降解的蛋白，如果你的蛋白是，加了之后，你会发现蛋
: 白量增加。这个药有细胞毒性，一般不能超过6小时。如果你的蛋白的HALF LIFE 很长
: ，那就看不到steady state level 的区别了。这个时候，需要同时加CHX，做TIME
: COURSE，观察蛋白的half life是否被延长。
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c******g
发帖数: 83 | 9 transient的话，蛋白表达量太大，基本是看不到区别的，如果实在不能做endogenouse
的，做成 stable cell line 也凑合
【在 r******k 的大作中提到】
: 非常感谢呀！ ！！ 但是加MG132 是不是必须是endoegous promoter 才有意义？ 如果
: 是transient expression我的两个蛋白的话 是不能用MG132研究他们的degradation的
: 对吧？
: 再次感谢！！
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r******k
发帖数: 446 | 10 请问可不可以对overexpress的蛋白可不可以又加MG132和CHX 一起treat？ 这样会不会
好些 因为myna的synthesis 也被block了。
endogenouse
【在 c******g 的大作中提到】
: transient的话，蛋白表达量太大，基本是看不到区别的，如果实在不能做endogenouse
: 的，做成 stable cell line 也凑合
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r******k
发帖数: 446 | 11 我现在想问下，如果必须做overexpression的 蛋白的half life。 是不是在
transfect 24hr或者48hr后加CHX比较好？？ 我看了一些paper，加了CHX后的time
course 时间很不一样，像我这种case，您觉得应该多久比较好呢？
endogenouse
【在 c******g 的大作中提到】
: transient的话，蛋白表达量太大，基本是看不到区别的，如果实在不能做endogenouse
: 的，做成 stable cell line 也凑合
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c******g
发帖数: 83 | 12 这要看你蛋白的half life.处理时间要接近half life 才行，要不看不出来变化。你要
自己慢慢摸条件。第一次，建议transfect 36hr后，加CHX 处理2/4/6/8/12个小时
【在 r******k 的大作中提到】
: 我现在想问下，如果必须做overexpression的 蛋白的half life。 是不是在
: transfect 24hr或者48hr后加CHX比较好？？ 我看了一些paper，加了CHX后的time
: course 时间很不一样，像我这种case，您觉得应该多久比较好呢？
:
: endogenouse
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r******k
发帖数: 446 | 13 HI thymine, 你好！ 你所说的translocation和 加CHX有联系吗？ 就是说如果加了CHX
， inhibit denovo protein synthesis的话，发觉 WT A 比 mutant A的half life要
短，这个跟他们的translocation能有什么关系呢？ 谢谢
【在 T*****e 的大作中提到】
: cycloheximide是inhibit denovo protein synthesis。
: 举个例子吧，比如你发现一个细胞事件很有趣、很重要。你想知道它是怎么被调控的。
: 那么有很多种可能，比如转录，转录后调控，翻译，翻译后调控。翻译后调控又分为很
: 多种，比如磷酸化修饰，translocation等等。那么怎么把目标范围缩小呢？早期的实
: 验方法，比如加转录抑制剂看看该细胞事件是否还发生，或者你说的这个加翻译抑制剂
: ，看看是否需要新的蛋白合成。比如学习记忆的机制里面，短期记忆有的需要蛋白合成
: ，你可以通过加蛋白合成抑制剂阻断动物的短期记忆来证明这点。而长期记忆还需要转
: 录的过程，那么你可以通过加转录抑制剂抑制长期记忆来证明。
: 研究一个protein的half life有啥意义？
: 我举第二个例子来说明这个。比如说现在很流行的用GFP这样的reporter来研究转录。
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T*****e
发帖数: 247 | 14 你好！你这个问题还是有点太开放了。我说到translocation的时候只是举个例子。
我最初的意思大概是这样：
1.有一个细胞外信号进来
2. 它引起了新的基因alpha转录，你检测到这个事件是在信号发生后三小时，那么这就
有两种可能：
A.新的转录因子（比如c-Fos）被转录，翻译后，然后这导致了alpha的转录
B.转录因子在信号刺激下入核，导致了alpha的转录
那么通过加cycloheximide，你抑制了c-Fos的翻译，那么你可以通过alpha转录与否判
断这跟c-Fos有没有关系。到底需要新翻译的转录因子还是只要translocation就够了。
但是关于你的例子，我不记得你是否还发了别的帖子说这个，但是你给的模糊的信息实
在只能让我瞎猜。
我就瞎猜猜看吧。
WT蛋白寿命比mutant短，这至少有两个层次的原因：
1.WT蛋白受降解调控的部分在mutant中被破坏了；
2.WT蛋白本身参与蛋白降解的机制
这里本来可以分开讨论，但你应该比我更清楚情况，所以欢迎你澄清哪一种更接近事实。
这可能跟translocation有什么关系呢？我不觉得在这里有什么直接的关系。
硬要扯的话，可能影响mutant的translocation的部分被破坏了。
这不是直接的关系，我觉得这个问题凭空而谈太复杂了。抱歉。
CHX
【在 r******k 的大作中提到】
: HI thymine, 你好！ 你所说的translocation和 加CHX有联系吗？ 就是说如果加了CHX
: ， inhibit denovo protein synthesis的话，发觉 WT A 比 mutant A的half life要
: 短，这个跟他们的translocation能有什么关系呢？ 谢谢
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r******k
发帖数: 446 | 15 ..
life
【在 r******k 的大作中提到】
: MG132 可以inhibit proteasome degradation， cycloheximide是inhibit denovo
: protein synthesis。
: 看了一些paper都是用这俩药，但是具体意义是什么呢？研究一个protein的half life
: 有啥意义？
: MG132 还可以induce 一些蛋白的nuclear translocation，why？
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H**T
发帖数: 426 | 16 有一个研究的蛋白用MG132处理2、4、6、8h，可以看到蛋白水平显著的下调，这个如何
解释呢？
【在 T*****e 的大作中提到】
: cycloheximide是inhibit denovo protein synthesis。
: 举个例子吧，比如你发现一个细胞事件很有趣、很重要。你想知道它是怎么被调控的。
: 那么有很多种可能，比如转录，转录后调控，翻译，翻译后调控。翻译后调控又分为很
: 多种，比如磷酸化修饰，translocation等等。那么怎么把目标范围缩小呢？早期的实
: 验方法，比如加转录抑制剂看看该细胞事件是否还发生，或者你说的这个加翻译抑制剂
: ，看看是否需要新的蛋白合成。比如学习记忆的机制里面，短期记忆有的需要蛋白合成
: ，你可以通过加蛋白合成抑制剂阻断动物的短期记忆来证明这点。而长期记忆还需要转
: 录的过程，那么你可以通过加转录抑制剂抑制长期记忆来证明。
: 研究一个protein的half life有啥意义？
: 我举第二个例子来说明这个。比如说现在很流行的用GFP这样的reporter来研究转录。
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x********e
发帖数: 35261 | 17 不一定是细胞周期蛋白。很多时候转录和蛋白合成都有周期节率
【在 s******y 的大作中提到】
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: life
: 意思非常大。
: 举一个例子，很多调节细胞周期的信号蛋白都是短寿命的蛋白，这样可以保证他们在做
: 完他们的工作之后即使降解被清除掉。如果这个过程受到干扰，弄不好会致癌。
: 很多种不同的原因，比方说因为一些该降解的废品蛋白没有被降解，导致细胞内出现
: misfolding stress.
: 还有一种原因是Ubiquitylated 的蛋白会改变他们的细胞内定位。
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