Q*****G 发帖数: 638 | 1 想在目的基因的N端或C端knockin GFP
利用cas9n d10a 载体,分别克隆2 guild RNA。
Donor repair template 突变掉guild RNA 序列。5'和3'flank分别为800bp左
右.转染(LTX/Fugene HD)完3天可以看见荧光.可是传代后荧光非常弱,还可以做细
胞分选么?
通常转染后多久细胞分选?
是否有更好的方法可以提高荧光的强度和crispr的效率?
谢谢 |
Q*****G 发帖数: 638 | |
Q*****G 发帖数: 638 | |
s********r 发帖数: 312 | 4 没有selection marker的话没办法富集,荧光弱不代表没有,继续往下做FACS就是了。
如果想心里有个谱的话,可以在FACS前一天,收一部分细胞,用genomic DNA做PCR检测
GFP integration,如果这个PCR都是negative的话就说明失败了,不用去做FACS了。
【在 Q*****G 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 想在目的基因的N端或C端knockin GFP : 利用cas9n d10a 载体,分别克隆2 guild RNA。 : Donor repair template 突变掉guild RNA 序列。5'和3'flank分别为800bp左 : 右.转染(LTX/Fugene HD)完3天可以看见荧光.可是传代后荧光非常弱,还可以做细 : 胞分选么? : 通常转染后多久细胞分选? : 是否有更好的方法可以提高荧光的强度和crispr的效率? : 谢谢
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l********e 发帖数: 415 | 5 d10a不好用,建议wildtype CAS9
【在 Q*****G 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 想在目的基因的N端或C端knockin GFP : 利用cas9n d10a 载体,分别克隆2 guild RNA。 : Donor repair template 突变掉guild RNA 序列。5'和3'flank分别为800bp左 : 右.转染(LTX/Fugene HD)完3天可以看见荧光.可是传代后荧光非常弱,还可以做细 : 胞分选么? : 通常转染后多久细胞分选? : 是否有更好的方法可以提高荧光的强度和crispr的效率? : 谢谢
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Q*****G 发帖数: 638 | 6 Thanks a lot!
Have already tried wt cas9, worry about higher off target effect. |