j*p
发帖数: 411 | 1 There has been quite a few RNAseq data released recently, many of them been
uploaded to UCSC genome browser as tracks (human and mouse). You may want to
try:
(1) go to that loci of the noncoding RNA you are interested.
(2) check RNAseq data and computational predicted tracks and see whether the
RNA is expressed, how many exons, what is the predicted splicing structure
etc.
(3) then RACE or you might want to test some functional study before RACE.
Personally, I doubted a noncoding RNA covers ~100... 阅读全帖 |
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a********k
发帖数: 2273 | 2 not if the alternative splice is the first exon
I cannot image a degrading RNA w/ different caps, though. |
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n******7
发帖数: 12463 | 3 另外，我确实在我们的reference sequence里面就观察到了 dual frame 的exon
non-coding RNA也有可能，有些gene会同时产生mRNA和mRNA-like non-coding RNA （
现在叫lincRNA似乎更多一些）
不过我们现在研究的使protein，ncRNA得过滤掉。。 |
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o**d
发帖数: 3080 | 4 pubmed: Gong Zhang, Zoya Ignatova
1.Polyglutamine expansion alters the dynamics and molecular architecture of
aggregates in dentatorubropallidoluysian atrophy.
Hinz J, Lehnhardt L, Zakrzewski S, Zhang G, Ignatova Z.
J Biol Chem. 2012 Jan 13;287(3):2068-78. Epub 2011 Dec 1.
PMID:
22134925
[PubMed - in process]
2.Length-dependent translation of messenger RNA by ribosomes.
Valleriani A, Zhang G, Nagar A, Ignatova Z, Lipowsky R.
Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 2011 Apr;83(4 Pt 1):04... 阅读全帖 |
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j*****9
发帖数: 716 | 5 在一遗传病大家系中先linkage定位，（前段时间出了一篇GWAS也是这段区域，没
有明确基因）然后在候选区域内通过exon sequencing找到两个错义突变（分属两个不
同的基因），都跟疾病共分离。两个基因跟疾病关系的研究文献都不多，其中一个基因
的功能目前还不太清楚。请教各位，如果不做功能研究，除找散发病例做大规模筛查之
外，有啥其他更好的方法确定到底哪一个是致病基因？谢谢！ |
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l**********1
发帖数: 5204 | 6 你老板没让你事先设计 reporter+ cassette modified vector 就做plasmid then
BAC transgene to Mouse 啦?
then 要证明Your transgene（insert）整合到特定locus
if yes plus next Long-range PCR does not work well.
return to start point then do below steps or similar steps:
Generation of knockin mice
Bacterial artificial chromosome (BAC) clone RP23-135A18
containing mouse genomic DNA encoding exon 1 of Zeb1 was
digested with PacI/SphI and SphI to yield 7.6-kb and 2.6-kb
homology arms, respectively, for targeting constructs (Figur... 阅读全帖 |
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o********r
发帖数: 775 | 7 30X一般是平均，具体到单个base，貌似现在publication的标准是80%以上（base or
exon）在20X以上。30X总还有不少base是没有任何coverage的。还有不少重要基因的
coverage总是比较低，比如NOTCH1 |
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v***a
发帖数: 1242 | 8 western有时也不一定吧。就像我举例的这个蛋白，如果抗体正好不识别某种组合的
exon方式，那也检测不出啊 |
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n******u
发帖数: 418 | 9 遇到这种情况就多试几个抗体了
针对不同的exon |
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n******u
发帖数: 418 | 10 同源重组也是有长度限制的吧？
有些比较大的gene，经常看到也就是flank在某几个exon的边上，而不是全部替换掉 |
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v***a
发帖数: 1242 | 11 谢谢专家的详尽解答！
下做KO的会尽量使mRNA丧失功能，比如造成移码突变等等，因此一般蛋白翻译会是无功
能的小片段，然后被清除了。因此考虑不周的话也会造成问题。比如一个蛋白有20个
exon，你切了第10个想让他KO
dispensable与否 |
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I***a
发帖数: 13467 | 12 如图，一般都是在exons 里面吗？后面有一大段non-synonymous coding 可以考虑吗？
多谢 |
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f*****f
发帖数: 195 | 13 你设计primer的目的是什么？假如要半定量mRNA的话，引物最好跨过两个不同的exon，
这样不至于以基因组为模板pcr。 |
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f*****f
发帖数: 195 | 14 比较基因的表达差异你是指mRNA水平？与原核不同，转录mrna会有剪切。
因为你提取RNA做qPCR时，有时不可避免的混入微量的基因组DNA，为避免检测干扰，一
条引物分别与不同的exon匹配，减少干扰。有专门的qPCR软件，比如免费的perlprimer
就可以，粘贴mRNA和基因组序列就可以了，引物对会有打分。 |
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I***a
发帖数: 13467 | 15 一般怎么考虑剪切这个问题呢？
特别是一些exons 的选择 |
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f*****f
发帖数: 195 | 16 首先ncbi上找到该基因 基因组序列和mRNA序列，
两个引物之间的intron越长越好。引物在exon和intron的边界最好，mRNA amplicon长
度我习惯设定100bp左右。
你可以下载一个perlprimer，有real-time pcr的选项，操作界面比较简单，你选择一
个引物看看在genomic/mRNA的哪个位置就应该大致明白了。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 17 推断
不会影响IRES dependent的translation
如果第一exon 比较短 后边有一个长的intron的话
if unlucky 建议你把Cre or similar target 放在后面的外显子里。比如，第2，3个
外显子。 |
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m******5
发帖数: 1383 | 18 如图，刚做好一个bac recombinnering的plasmid
想同时用tag标记C-terminal,另外因为是最后一个Exon，所以可以用是recapituate
endogenous 3,UTR调控，没有加artificial polyA
现在的问题是，因为种种原因，FRT-Neo-FRT不得不插在如图mCherry和3'UTR中间的位置
麻烦来了
1, 因为Neo selection marker和我的基因是同向的，在FRT-Neo-FRT不删除的情况下，
我的基因是否会用上Neo 的3'UTR(SV40 polyA)
2,哪些方法可以最快地删除Neo?我听说有bacterial表达flipase的，但四处找不到
commercial的 |
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m******5
发帖数: 1383 | 19 even in my case ? it
is in between of my last exon and 3,utr |
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u*********1
发帖数: 2518 | 20 关于治疗：
我表示非常无奈。这是绝症中的绝症，而且是最没人道的绝症。
所以家里能做的，就是好好调养好好护理，争取能延长生命。不抛弃不放弃。
关于研究：
大部分的研究成果还是在10%的familial ALS，找到一些基因。但SOD1也不能解释全部
的FALS。而这些FALS的基因突变，只能在2%的很少一部分的SALS的序列里找到。也就是
说，90%以上的病人，我们对基因组上的突变是一无所知的。
最郁闷的是，哪怕是FALS，也发现了很多不同的mutation。感觉现在是在一个一个的打
靶，碰运气找到一个基因就是一个。最后感觉这个疾病和乱七八糟的各种pathway都有
关系，就是我们永远搞不清楚到底怎么回事。
ALS的病人少，而且发病死亡快。所以找到大规模家族的样本，采样测序什么的很困难
。同样，GWAS的研究的样本也要少很多，所以power很低。而且纵然是GWAS的研究目前
也是针对白人。
当然也有振奋人心的新闻，一个是cytoplasmic inclusion of ubiquitinated TDP-43
存在于几乎所有的ALS sample里，也就是找到了syndrome mark... 阅读全帖 |
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m******5
发帖数: 1383 | 21 300bp确实没什么好担心的，要是中了楼主买彩票吧 |
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D*a
发帖数: 6830 | 22 300bp没问题，但是设计个digetion site也不麻烦，还可以留着用，何乐而不为 |
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m******5
发帖数: 1383 | 24 我觉得既然没问题可以不用设，楼主的情况也许没交代清楚，兴许他的loxp在敏感区域
，能减少改变就得尽量减少？(比如5,UTR, splicing site) |
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m******5
发帖数: 1383 | 25 我的意思是楼主不用担心loxp丢掉，至于能不能用是另外一回事
一听到自己不用做老鼠的就妒忌得不行……做construct打ES再等germline
transmission 最后等表达等phenotype多折腾人啊！！！
设计那么多酶切位点太夸张了，我觉得只要PCR sequence一下就可以了
800 bp那个floxed region他们设计酶切位点是precautions?最后有发现只有一个loxp
的克隆么？我看文献里报道了这种情况的都是2k floxed region才发生的。 如果800
bp能发生岂不是说明short arm只要800bp就能做targeting? (当然也可能，不过300bp
我觉得如果发生了可以发个genesis报告了)
http://www.currentprotocols.com/WileyCDA/CPUnit/refId-mo100159.
鼠女王能帮忙下载一个paper么？ |
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D*a
发帖数: 6830 | 26 汗。。。叫得太那啥了吧。。。
这篇在pubmed自己的数据库是free，你可以从pubmed过去，我email给你也行。
我们老鼠是不用做了，买cre再跟cre交配也要交一年啊。。。
loxp
300bp |
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m******5
发帖数: 1383 | 27 刚造了个老鼠还要再买allelle配两个上去的苦命默默飘过……
你能下载到final version么？NIH manuscript 看得很难受
w****[email protected]
Thanks!!!!!!!!!!! |
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r*******y
发帖数: 48 | 30 1. floxed 300 bp should not present any problem for recombination;
2. introducing a disgestion site is a good and reasonable design for future
southern verification, if there is no endogenous restriction site(s)
available for southern strategy;
3. you should pay more attention to the design of the arm length. Based on
my experience, over 5000bp/arm is recommended; shorter than this will reduce
the specific recombination efficiency, although some reports also suggested
that a shorter arm also wor... 阅读全帖 |
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h********n
发帖数: 4079 | 31 it depend on how the KO was made, whole gene deletion or some exon deletion.
1. check genomic DNA by sequencing the specific area.
2. Check mRNA by sequencing. |
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p*****p
发帖数: 61 | 32 不是很明白你的问题：
你的差异表达分析是对什么最差异分析（差异表达的Tag）？
对于组装很完善的大鼠大基因组，要注意的是不要把那些短的CONTIG一起全部做
REFERENCE，可能会给MAPPING带来问题--比如很多CONTIG和主要染色体有序列高度相似
的地方，会导致最后这些地方没有MAPPING报告。具体没有做到过大鼠，猜测可能有这
样的问题。
至于后面的差异分析，我的理解是，如果你提供了基因的注释（ANNOTATION）要基于
MAP到一定的基因特征（EXON，ISOFORM，GENE）上的READS的分析。那么你用哪个版本
的注释比较会影响你说到的有很多对不到基因上（你用的那个注释的版本和你关注比较
的基因不完全的一样）。
要是用泪水CUFFLINKS类似的工具不提供基因组注释而组装的ISOFROM 或者GENE的分析
，如果发现差异表达的ISOFORM或者基因不在作者感兴趣的基因序列里，只能说明这些
工具从RNA-SEQ数据发现了新的基因了。
不知道是不是猜对你的问题。 |
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h*****G
发帖数: 113 | 33 大家好，小弟最近构件质粒，插入GFP到一个基因的intron，利用endogenous的
promoter来表达GFP。基本的思路是Slice acceptor sequence-2A peptide-GFP, 因为
intron之前的exon没有刚好in frame, 所以需要在SA和2A之间加入几个碱基。现在的问
题不知道具体的SA 序列，在Addgene上看了几个plasmid，都没有把具体的序列位置给
标出来，所以也搞不清楚。比如这段序列是addgene一个plasmid的，表明是SA－2A序列
，也知道［］中的是2A序列。但是前面的话具体那段是SA呢，如果我需要在SA和2A之间
插入连个碱基，应该在哪里插入呢？
gcaagcttctgacctcttctcttcctcccacagggcctcgagagatctggcagcg［
gagagggcagaggaagtcttctaac
atgcggtgacgtggaggagaatcccggccct ］
或者各位大侠有没有常用的SA序列呢？非常感谢帮助指导。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 34 De rien.
plus this one:
Shioda N et al. (2012)
Expression of a Truncated Form of the Endoplasmic Reticulum Chaperone
Protein, σ1 Receptor, Promotes Mitochondrial Energy Depletion and Apoptosis
JBC 287: 23318-31.
Abstract
The σ1 receptor (σ(1)R) regulates endoplasmic reticulum (ER)/mitochondrial
interorganellar Ca(2+) mobilization through the inositol 1,4,5-
trisphosphate receptor (IP(3)R). Here, we observed that expression of a
novel splice variant of σ(1)R, termed short form σ(1)R (σ(1)SR), has... 阅读全帖 |
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s******a
发帖数: 252 | 35 1) Are you using a custom chip or something like Affymetix? You usually get
data on "ProbeSet" not probes. It's a big difference.
2) If this particular gene is not important to you, forget it;
else:
3) Are data on each probe statistically significant?
If so:
4) verify the probe sequences. Look them up in the genome to make sure they
correctly match to your gene and the same transcript. Watch for different
exons for spliced variants. Watch for common SNPs in case mismatch occurs.
5) If you don't ... 阅读全帖 |
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i*****g
发帖数: 11893 | 36 我搞错了，yeast 有5000个基因（all single exon），所以，仅仅一个yeast，理论上
有这6*5000/2个关键
而且，这个是静态的关联，there are connection changes in cell cycles
2003年最后1个月，我大概就形成了这个观念：所谓生物，就是这些connection的总和
，一个很结构主义的观念。 |
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t******y
发帖数: 716 | 37 请问谁碰到过类似的情况？
一个转基因老鼠，目标基因A的exon 1被lacZ基因取代。但是从突变体纯合子分离到的
原代细胞里还是能够检测到目标蛋白A的表达。用qPCR检测目标其mRNA水平虽然要比野
生型少很多，但是也能够检测得到（大概是野生型的百分之五左右）。exon1包括翻译
起始位点ATG以及后面大概250个碱基。此突变体纯合子表型明显，杂合子没有表型。 |
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b******n
发帖数: 4225 | 38 你突变体纯合子能被抗体检测，是western还是免疫组化？
突变体纯合子的mRNA可以做primer extension，看看是不是有alternative start
codon
想降低qPCR本底水平，引物可以设计一端priming在exon1，另外一端在别的exon或者5'
-UTR |
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c****l
发帖数: 1086 | 39 这不是很正常吗，你的ko可能是in frame 的exon 1 replacement，蛋白的其他domain
还在， 如果你的抗体是polyclonal或是别exon1以外的epitope，当然可以监测到了 |
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t******y
发帖数: 716 | 40 插入的lacz后面有一个stop codon，而且exon 1 里面包括进入内质网表达的信号肽，
这样还会表达蛋白的其他domain吗？
domain |
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b*****o
发帖数: 150 | 41 E coli的Stop codon的使用频率和真核生物的使用频率是不一样的。如果使用了老鼠不
常用的stop codon，那就很有可能"通读"了。
建议你在KO EXON的上游和下游各设计一对QPCR引物，然后检测就能知道你的STOP
CODON是否起作用。 |
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i*****g
发帖数: 11893 | 42 测是肯定可以测的，技术巨大进步
不过，我依旧认为对改善就业没有帮助
现在已经有不少疾病锁定了基因，但治疗呢？ 你知道某transcripts少了1个exon，导
致疾病了，可你怎么治疗这个疾病呢？
从生物基础角度看，医学临床是我们的工程，
如果不能用上临床，就赚不到钱，
赚不到钱，千老还是千老
唉，不容易啊 |
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n******7
发帖数: 12463 | 43 很有意思的是，
intron 长度大概比 exon高两个数量级
non-coding DNA大概也比 coding DNA长两个数量级
DNA elements的研究还是很多的，比如ENCODE project
虽然就像你说的，离真的搞明白还是遥遥无期。。。 |
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H*H
发帖数: 472 | 44 此人感觉已经精神分裂了！
看你发的帖子，你自己是做老鼠转基因的！还要装成自己不是搞生物的，然后大义凛然
的样子。。。。。
如果没搞错的话， 这是你发的帖子吧。。。
“请问谁碰到过类似的情况？
一个转基因老鼠，目标基因A的exon 1被lacZ基因取代。但是从突变体纯合子分离到的
原代细胞里还是能够检测到目标蛋白A的表达。用qPCR检测目标其mRNA水平虽然要比野
生型少很多，但是也能够检测得到（大概是野生型的百分之五左右）。exon1包括翻译
起始位点ATG以及后面大概250个碱基。此突变体纯合子表型明显，杂合子没有表型。
” |
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u*********1
发帖数: 2518 | 45 如果你不是做技术开发，就直接的PCR+sanger sequencing
尤其因为你的样本不多，而且只做一个基因（当然一个基因或许有multiple的exon）
如果你要做比如3000个sample，同时做40个基因，那这个方法肯定就不行了，
最先进的办法请看：
Multiplex Targeted Sequencing Identifies Recurrently Mutated Genes in Autism
Spectrum Disorders
http://www.sciencemag.org/content/338/6114/1619.abstract
当然未来whole exome测序的成本变得非常非常低的时候，这方法估计也要淘汰
btw，上面的science paper测了几千个样本的44个基因，最后也就发现6个recurrent
de novo mutated gene，也只能解释1%的sporadic ASD，所以我觉得disease genetics
还是任重道远 |
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G***G
发帖数: 16778 | 46 any ideas? One baozi as reward. |
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a******8
发帖数: 56 | 47 I use www.ensembl.org though I am not sure if I got your question clear. |
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s******s
发帖数: 13035 | 48 你要多准确？一般的，各大网站不是都有？否则，就算seq出来的都不一定全 |
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