a******s
发帖数: 6 | 1 Thanks. I am trying to clarify my question.For most of transcription factors
, there is a specific binding site (consensus sequences) on DNA for them to
bind. Without them, no binding. We can use ChIP or EMSA to test it. However,
for histone, there is no specific binding site on DNA. But histone binds to
any DNA. So we call that the histone-DNA binding is specific, but non-
sequence specific.But for some proteins, they may have some kind of
association, but not direct binding with DNA. So my que... 阅读全帖 |
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m*b
发帖数: 1421 | 2 有没有公司可以提供histone peptide array服务的
就是我给蛋白，他们测定这个蛋白识别哪个histone modification mark
刚鉴定一个蛋白应该是histone相关的
但是不知道识别哪个histone mark
自己做的太费时
谢谢！ |
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R******d
发帖数: 1436 | 3 请问基因的histone modificastion由哪些因素决定？
基因的histone modificastion又会决定哪些别的因素？
Dna的modification和histone modificastion是有联系的吗？
多谢了。 |
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R****n
发帖数: 708 | 4 我在细胞系里敲出了一个histone methyltransferase,下一步想看看nucleosome
conformation change. 我想了解下有什么可行的方法？
TCA 提histone 已经做了，可不可以用这些histon组装nucleosome，似乎需要严格控制
h2a h2b h3 h4的比例. |
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m******5
发帖数: 1383 | 5 小弟正在试一个histon和一个转录因子的co-ip条件，十分没头绪
因为histon太特殊了，理论上说有效的相互作用是dna dependent的
可是在体内要如何拉到DNA dependent的相互作用呢？
之前听说过的最麻烦的co ip是transcriptional elongating 复合体，要把整个复合体
连RNA一起拉下来研究 |
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a******s
发帖数: 6 | 6 We know now that the binding between histone and DNA is specific and non-
sequence specific.Do you guys know how to prove that the histone-DNA binding
is specific, not non-specific? especially at the initial stage of this
study. I couldn't find any paper. Thanks a lot. |
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R******d
发帖数: 1436 | 7 这两者之间存在相关性是吧。请问是histone modification决定/指导underlying DNA
methylation多一些，还是反过来？
再请问一句，有没有报道全基因组rest T4 cell的DNA methylation profiling?
zhao keji 做了rest T4 cell的histone modification，nucleosome occupancy，好像
没有做DNA methylation profiling？
多谢了。 |
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c********r
发帖数: 189 | 8 Histone H3 不应该主要在nuclei里吗？为啥我做cell fractionation, 分离nuclear和
cytoplasmic fraction, 每次western blot里cytoplasmic fraction的histone H3 最
多。
cell fractionation的问题 还是抗体的问题，还是本来就是如此？郁闷啊。 |
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c********r
发帖数: 189 | 9
其实我要检测的是nuclear里的chromatin bound protein，所以histone H3比较好。我
在裂解之前，先count细胞，然后裂解细胞膜后，count nuclei （这时候nuclei可以被
stain）至少90%的细胞裂解了而且保有完整的细胞核。结果cyto里还有Histone H3，于
是我就无语了 |
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c********r
发帖数: 189 | 10 Histone H3 不应该主要在nuclei里吗？为啥我做cell fractionation, 分离nuclear和
cytoplasmic fraction, 每次western blot里cytoplasmic fraction的histone H3 最
多。
cell fractionation的问题 还是抗体的问题，还是本来就是如此？郁闷啊。 |
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c********r
发帖数: 189 | 11
其实我要检测的是nuclear里的chromatin bound protein，所以histone H3比较好。我
在裂解之前，先count细胞，然后裂解细胞膜后，count nuclei （这时候nuclei可以被
stain）至少90%的细胞裂解了而且保有完整的细胞核。结果cyto里还有Histone H3，于
是我就无语了 |
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R******d
发帖数: 1436 | 12 呵呵，我不做数据库，我是想学习一下。要不你把你知道的贴个链接给我？
我的想法是：现在很多文献都说histone modification的作用是active或者repress转
录，但是好像这个作用并不是直接的。我想看看有没人把histone modification的直接
功能给整理出来。个人想法，未必对哦。 |
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s********r
发帖数: 312 | 13 原来histone跑胶还要特别处理啊，长见识了...怪不得前一阵做nuclear
fractionation想用histone做内参，怎么搞都搞不出来。。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 14 把样品狠狠地vortex 了几次
RE: 到底是哪个起了作用也不知道
发信人: dahuzi (huhuhu), 信区: Biology
标 题: Re: histone western blot 求教
发信站: BBS 未名空间站 (Mon Aug 19 10:06:12 2013, 美东)
我估计是没有把histone从细胞核里面释放出来。bla bla ba |
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r******k
发帖数: 446 | 15 我就用1 percent的 sds的RIPA。 但是最主要的是你的GEL是不是15%的？因为histone
很小 如果不是 你肯定跑不出来 histone是非常strong的band 我5ug都能做出来。。 |
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s******s
发帖数: 1584 | 16 RSC下的一个杂志，IF 3.3， 文章跟LC-MS, Histone modification, statistics 有关
最好能把大致研究方向跟Publication发给我，最好是今天。
顺便485求祝福~谢谢！ |
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h*y
发帖数: 208 | 17 请问如何寻找与Transcription start site相关的 specific histone modifications? |
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y*********1
发帖数: 46 | 18 You can look up Keji Zhao's Cell paper: High-resolution profiling of histone
methylations in the human genome.
H3K4me3 would be a good marker for TSS. |
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A******y
发帖数: 2041 | 19 Huh? You have x-ray crystal structure showing you that it is binding to the
DNA. The same paper also reconstituted the chromosome using DNA and
histone. In addition, you can see nucleosome with cryo-EM. In real
physical world, binding specificity is achieved through affinity, if you use
enough of DNA and enough random protein, they will bind except it has no
biological significance and just aggregation. To answer your question, even
BSA can shift a DNA gel if you used enough to aggregate th... 阅读全帖 |
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o**i
发帖数: 1165 | 20 假如promoter附近一点已知histone modification都没有 这样的gene是不是一定不表
达 |
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o**i
发帖数: 1165 | 21 假如gene promoter附近 一点histone modification都没有
这样的gene是不是默认是silent的? |
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Z******5
发帖数: 435 | 22 只有promoter附近？其它位置呢？
貌似X染色体上很多histone modification的信息都没有，估计是异染色质比较难做出
结果把。 |
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A******y
发帖数: 2041 | 23 I don't think that's enough to proof it. How about histone methylation or
DNA methylation near the promoter. How about heterochromatin markers such
as HP1? |
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n***g
发帖数: 5027 | 24 最好是有那些能够modify histone的蛋白的summary。
O(∩_∩)O谢谢 |
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s*********t
发帖数: 600 | 25 ......
Tony Kouzarides
Yi Zhang
Danny Reinberg
写的吧。
比如
Regulation of chromatin by histone modifications.
Bannister AJ, Kouzarides T.
Cell Res. 2011 Mar;21(3):381-95. Epub 2011 Feb 15. |
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A******y
发帖数: 2041 | 26 Simplified version for acetylation is number 2. However, acetylated histone
also recruit activation factors and displace silencing factors. Usually
for all transcription number 1 combining with number 2 is correct, don't
forget the HAT/HDAC has to be regulated to know which genes to turn on and
off. |
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R******d
发帖数: 1436 | 27 很有意思，多讲两句吧。包子发了。
histone
Usually
and |
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z*t
发帖数: 863 | 28 现在不是很清楚，比如在Neuro Spora中先有H3K9me3然后有dna methylation,哺乳动物
里Dnmt3a/3b/3L形成复合物binding到H3K9me3的site然后methylate DNA,LSD1 KO会造
成defiency in imprinting, G9a KO也会造成methylation decrease
而早一点的发现dna methylation也可以招募MBD/MePG之类造成histone去乙酰化，还可
以招募H3K36的demethylase。这两者是interwine的关系,谁先谁后目前还没定论。。。 |
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z*t
发帖数: 863 | 29 现在不是很清楚，比如在Neuro Spora中先有H3K9me3然后有dna methylation,哺乳动物
里Dnmt3a/3b/3L形成复合物binding到H3K9me3的site然后methylate DNA,LSD1 KO会造
成defiency in imprinting, G9a KO也会造成methylation decrease
而早一点的发现dna methylation也可以招募MBD/MePG之类造成histone去乙酰化，还可
以招募H3K36的demethylase。这两者是interwine的关系,谁先谁后目前还没定论。。。 |
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s******s
发帖数: 13035 | 30 都有吧。不过DNA methylation细胞分裂还能保持，histone的还是比较有争议。
你那个profiling不知道是什么？如果是指全基因组测序的话估计没有，enrichment
这种有可能。
DNA |
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z*t
发帖数: 863 | 31 I don't quite understand "or gate", but the point you mention is right
according to nowadays finding. The instructive relationship also depends on
the specific content, like 1 instruct 2 in setting A, but 2 can instruct 1
in setting B ...
Histone modification may be quite clear, but DNA methylation is still
enigmatic. |
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e*****t
发帖数: 642 | 32 请大家推荐几篇关于DNA methylation和histone modification两者之间关系的review.
多谢 |
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c********r
发帖数: 189 | 33
10
H3
最后发现时H3 抗体的问题，换了种抗体，好了，一般来说transcription factor和
Histone 之类的都应该主要在nuclear fraction里 |
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c********r
发帖数: 189 | 34
10
H3
最后发现时H3 抗体的问题，换了种抗体，好了，一般来说transcription factor和
Histone 之类的都应该主要在nuclear fraction里 |
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f*c
发帖数: 2726 | 35 我做了whole cell lysate,也做了nuclear lysate (相当于nuclei enrichment吧），
都没有，我甚至用了histones from calf thymus，都没有带，诡异阿 |
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d****i
发帖数: 2346 | 36 我估计是没有把histone从细胞核里面释放出来。我做过whole cell lysate和nuclear
的，都很好做，就是普通的gel。抗体估计不是问题。 |
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B*H
发帖数: 2158 | 37 楼主，你就不能不跑胶，先做个DOT BLOT看看是不是抗体的问题。ACTIVMOTIF也有好多
HISTONE的抗体可以试试。我用他们家H3的挺好的。 |
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s*****g
发帖数: 7857 | 39 俺也用cell signaling的histone 抗体,还行啊 |
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Z******5
发帖数: 435 | 41 质粒好像没有真核复制起始位点吧？应该不能复制。
Histone deposition我也一直很好奇，不知道哪里有这方面的信息。
另外一个问题就是进入细胞的质粒的量的问题。我们普通做瞬转，如果假定转染效率是
100%，那么进入单个细胞的质粒数目大概能达到上亿的数量级。这是很夸张的一件事，
除非转染效率低得离谱。 |
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c********b
发帖数: 363 | 42 起码在植物里不是这样。
不能进细胞核的质粒很难表达，因为很难接触转录酶系。植物病毒的DNA（和环状质粒
差不多）有时会进细胞核并被histone包裹 |
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m******5
发帖数: 1383 | 43 弱弱地说一下，我记得plasmid进核基本是一定的，除了植物里importin alpha介导有
人已经说了，哺乳动物细胞是由importin T介导的（STH like that）
另外，我觉得可以做几个thought experiment
1,如果只有M phase plasmid才能趁着核膜解体进核，那酵母里转染基本是mission
impossible了（因为酵母核膜不解体）。
2，如果只有M phase plasmid才能进核，我们转染293T是不可能在24小时后达到80%的
transfection efficiency without doubled cell number.
3,如果M phase plasmid才能进核，是否表达外源质粒早就会被发展成鉴定是否post -
mitotic cell的标准了。
…………我觉得还有很多例子。
最后弱弱地说一下，我之所以想到这些粒子，因为我似乎看到过把质粒转进去再pull
down下来看sequence specific histon deposition的，啊哈哈 |
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r******k
发帖数: 446 | 44 我做H3K9的 methylation的变化，90v，90min，结果做出来一大团黑。。。。。太崩溃
了，但是其他的histone marker还很正常。 就这个H3K9的 总是一团黑，真心没法活了
。 大神们有什么建议吗？ |
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g****0
发帖数: 425 | 45 不知道，转染的plasmid会不会有histone modification？谢谢先 |
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R****n
发帖数: 708 | 46 最近在做一个DNA和histone甲基化共染色，主要是想看在chromosome上的分布。先拿
colcemide处理2小时，然后放0.075M KCl，滴到玻璃板上。染了几次，细胞核都打不开
，也看不到一条条染色体。要是只用DAPI，能看到100-200个核中有一个能打开，但是
很不稳定。看protocol,有两个可能的问题。
1）我是悬空滴的，效果不如用cytospin?
2) 玻璃板没有poly-lysine coating,沾不住chromosome.
有人能提供点经验么？这方面是新手。 |
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D***a
发帖数: 516 | 47 有文章报道这种情况吗？另外有没有一个histone remodeling complex结合两个H3
tail的情况？ |
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m******t
发帖数: 109 | 48 最近做histone Wb，没bands。别人的文章看起来很容易，方法也没有任何特殊说明。
请教做过的各位了。 |
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p******b
发帖数: 379 | 49 裂解液不够强？ histone可能需要比较强的去垢剂 |
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f*******d
发帖数: 92 | 50 Histone 是很容易做的，要sonicate cell lysates, 确保细胞核裂解，RIPA buffer绝
对没问题。如果没有的话，1% SDS ＋ heating也很容易看到，如果还看不到的话，用
8M UREA+RIPA, 这样的话，即使在胶上都能看到很强的band. 此外这个protein特别小
，好像15还是18kD, 所以胶别跑过了。 |
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