b******k
发帖数: 1874 | 1 这个正是太巧了。我也想问这个问题的。可否再详细一点？
oligo默认都是末端Pi的吧？
怎么在TE中变性复兴？oligo的浓度、反应的时间？和载体的比例，连接时？
过量加长？
谢谢 |
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l*********s
发帖数: 5409 | 2 Nay, the 5-prime end of synthesized oligos is normally hydroxy group, you
need to order additional modification.
For annealing, water is also OK.Just throw oligo solutions in boiled water
and let it cool naturally.
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b******k
发帖数: 1874 | 3 3'prime of oligo is default hydroxy group,right? not 5'prime.
why do we need to add 3 prime Pi to the oligo before annealling?
thanks. |
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a****o
发帖数: 1786 | 4 Is it possible to synthesize a short RNA oligo with NH2 at 5', anneal this
oligo to your single strand DNA template, add T7 RNA polymerase to
transcribe. The yield may be low, but the incorporation efficiency should be
really high. :))) |
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w******e
发帖数: 1187 | 5 I didn't know you can do that... so let me confirm: you mean, by anneal
a RNA oligo to a ssDNA template to make partial strand, the T7 polymerase
actually synthesize RNA by adding NTP to the existing RNA oligo, kinda
like a primer?
be |
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T**********t
发帖数: 1604 | 6 我在东北部。
我们一直是在IDT定oligo的，就是前段时间在这里看到你们讨论sigma的oligo service
说是又便宜又好才决定试一下他们，没想到直接杯具了。 |
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b******k
发帖数: 1874 | 7 Hi, anyone have tried to increase annealing/extension Tm 5 degree higher
than default setting , when using ABI's Power SYBR® Green PCR Master
Mix to do realtime pcr? this is my first time to work with sybr green.
I designed a bunch of primers, and just found the Tm of all oligos (by
VECTOR NTI's oligo analysis) is 5 degree higher than that primer express 2.0
calculated.
Many thanks. |
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s********n
发帖数: 2939 | 8 Thanks. Actually I know these companies for gene synthesis. However, I am
looking for those who could synthesize oligos as long as possible. Now I
only know IDT could synthesize 200 bp oligos with confidence. |
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s*********s
发帖数: 110 | 9 我送你一个，屡试不爽的~
1.Computer-Aid Primer design
http://www.bioinformatics.org/primerx/cgi-bin/DNA_1.cgi
2.Mutagenesis(20uL) :
5XBuffer: 5uL
dNTP(5mM):0.5uL
oligo(F):0.5uL
oligo(R):0.5
template:100ng
DMSO:1.25uL
Phusion:0.3uL
Add water to 20uL
PCR setup
98 C, 30'
98 C, 10' --
65 C, 30' -- (X 23 cycle)
72 C, 4min --
72 C, 10min
4 C, forever
3.Dpn I digestion( 1uL and at least 3 hours)
4.transformation(5uL) |
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w*****i
发帖数: 54 | 10 不好意思，三个不同的design
是啥意思
我知道capture的时候，有的用 oligos, 有的用chip
你的意思是设计oligo/chip时候就限制了exome的size 是38M,44M,50M? |
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c********b
发帖数: 363 | 11 I used Invitrogen GeneRACer kit，which suggested nested-pcr.
Invitrogen's oligo adapter is about 60 nt，first PCR used adapter 5‘-end ~
30 nt primer and gene specific（GS) primer. Then they use close to adapter 3
'-end nested primer and another nested GS primer.
After the nested PCR, I sometimes still see multiple bands. I have to gel-
purify the PCR products with correct size and sometimes to repeat 2nd PCR to
amplify it before cloning.
One suggestion is to purify mRNA for RACE, which gives you mu... 阅读全帖 |
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d****7
发帖数: 109 | 12 别急，如果合成两条互补链oligo然后退火的话，记得纯化方法一定要选最高的（HPSF
绝对不行，最好是PAGE纯化的），否则会有很多合成失败的垃圾影响接下来的连接。
还有，如果你是设计的oligo带overhang的话，记得用PNK给5'端加磷酸，因为化学合成
的5'端不带磷酸的，没磷酸是连不上的！ |
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a*******a
发帖数: 4233 | 13 加磷干啥，浪费钱。载体是切开的两头就有磷了
合成的oligo加不加无所谓的。
最简单粗暴的方法
两条sequence，反向互补， 末端带粘性末端
干粉稀释成100uM，各取5ul变性梯度退火
然后1/10, 1/100,1/1000三个梯度稀释，直接取1ul做连接
根本不用纯化。 注意oligo浓度高了会抑制连接。 |
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s*******t
发帖数: 7746 | 14 SiRNA is NOT specific.
use Morpholinos oligos (made by Gene Tools,LLC, http://www.gene-tools.com/). It is antisense oligo with high specificity, stable in the cells (can not degraded by RNAase or DNAase or Proteinase etc). I have used Morpholinos in cell culture and mouse. Work really well. |
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s*******t
发帖数: 7746 | 15 Not completely true. A well designed antisense oligo along with proper
controls, antisense oligo can be specific. |
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r******y
发帖数: 21907 | 16 第二步不止一条条带，大小对的条带比较弱 还有你说的overlapping region是指的
primers，promoter reverse and gene forward prime有overlapping吗？是的话 大约
有10 bp overlapping oligos还是说这个overlapping region有其他的oligo代替？
thanks!【 在 Chamgrape (香槟葡萄) 的大作中提到: 】 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 17 oligo dT 没错 如target gene 只有一段很短的碱基序列(<120bp) 已知
而没有任何其上游5' 或下游3'的序列信息
只能用oligo dT qRTPCR 从poly A tail 揪出那条mRNA to single strand cDNA
then to double strand cDNA the 附加带酶切位点的各种adapter
再用那些人工加入的带确定碱基序列的 adapter 5' to 3' 对应的 反链 3' to 5' 的引物
PCR cycling
具体步骤请看图:
snap copied and pasted from
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC50225/ |
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s****n
发帖数: 234 | 18 Microwave method
(Use this for checking integrants)
Smear fresh colony using pipette tip on bottom/walls of a small PCR tube.
Microwave PCR tubes or strips (without lids) for 90 sec in PCR rack.
Resuspend dried out yeast in 25 ul of PCR reaction mix (with Taq already
added) and perform PCR.
Note: Do not overload PCR rack when microwaving--no more than 3 strips
of 8 tubes per microwaving or heat dispersal becomes an issue.
Alkaline lysis method
(Use this for cloning or for checkin... 阅读全帖 |
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g*********5
发帖数: 2533 | 19 can't agree more...
recently found 2 oligo have some effects on one proteins expression,
but further study showed other 5 oligoes could not have similar results... |
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c******r
发帖数: 3778 | 20 直接order IDT的RNA oligo不行。
但是IDT的网站看上面的pull down list，有一项是gene silencing。那个是专门的
RNAi oligos。有predesign的，也可以customize。 |
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n****3
发帖数: 543 | 21 刚收到那家公司的回复， The sales price of the machine is $48,500. The cost
of per-base is $0.07 for 50-mer long and 25 oligos per run. 并没有节省多少
花费。 我所了解的引物价格， 最便宜的是Eurofins MWG Operon: plate oligo，$
0.07/base, 但交货晚4－5天，在时间上没法与同行竞争。
看来二手的常规合成仪靠谱，谢谢楼上的链接，
还有一个问题，如果买个二手合成仪，自己动手合成引物，引物成本大约是多少钱一个
碱基？ 试剂据说也很贵，
如果大家知道还有更便宜的引物合成公司，周期也短，请推介一下。谢谢 |
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H*****e
发帖数: 120 | 22 Whenever I review manuscript with knockdown. I have two requirements:
1. By multiple sequences.
2. By western-blot. Even you can detect it by array or PCR, I still ask you
to do it because I feel I am being fooled. Many knockdown in my hand is
partial blocking translation + partial inducing degradation.
For certain cases, I ask for stable lines not oligos. For these reasons, I
had rejected quite few manuscripts from China. They like to show knockdown
using oligos and like to show knockdown ef... 阅读全帖 |
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c******t
发帖数: 108 | 23 今天被lab mate 问到合成first strand cDNA的原理，发现自己以前确实没想太多。
请教大家呀：
我们用的是M-MLV，
1. 一开始的65度5分钟到底是为了打开mRNA的二级结构，还是为了打开二级结构加配对
oligo dT? 2. 65度后立马冰浴的时间要多长？目的是让打开二级结构后的mRNA保持状
态，还是使oligo dT引物与RNA配对？
3. 最后的80度5分钟是只为了灭活酶活性，还是还有别的意义？
4. 看到有些protocol说要加DTT，意义在何处？
5. 在哪个权威网站或database比较容易找到一些实验的原理精解？
多谢啊！ |
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c*****u
发帖数: 357 | 24 引物能p出东西就行，验证的时候尽量加positive和negative control
关于knockdown， 你有没有比较forward 和reverse 两种方法，有的时候在效率上会差
很多（如果你用的脂质体的话），GFP那个其实也不能很好的决定你target gene的
knockdown效率，还是在oligo的选择和oligo和转染试剂比例上找条件，可以买
validated siRNA，成功率更高些 |
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k********n
发帖数: 756 | 25 Oligo是不是很快被降解，需要重复转OLIGO？ |
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发帖数: 1 | 26 有没有人用SMARTer 方法做RNAseq？我不小心把SMARTer IIA oligonucleotide 放-20
了，还能用吗？这种oligo是一个oligo前边是DNA后面五个nt是RNA，是不是存在-20就
不能用了？ |
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m****a
发帖数: 270 | 27 连韩春雨的论文都没看懂在这儿瞎逼逼，还 enzyme-ssDNA，there is always an on/
off equilibrium.
麻烦你去看看论文原文和supplemental figure 1
NgAgo is faithful to its original guide and does not allow DNA swapping at
37 °C (Fig. 2d), similar to mammalian Ago2, which cannot exchange its bound
oligos with free oligos at 37 °C. This feature of NgAgo minimizes the
possibility that it will be loaded with unexpected ‘guides’.
。。。。NgAgo follows a ‘one-guide-faithful’ rule, that is, a guide can
only be loaded when NgAgo protein is in the ... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 28 9月28日Joe Miano
Most of you have already moved on from this discussion but I wanted to chime
in one last time with our negative data in the mouse. Whether we used
original plasmid or a custom NgAgo that was codon-optimized for mouse with
untranslated sequences, a Kozak Methionine, and polyA tail the results were
uniformly negative. We used a 5' phosphorylated ssDNA (both IDT bought or
in vitro phosphorylated) along with the mRNA to codon-optimized NgAgo and an
HDR template we used successfully ... 阅读全帖 |
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r**********e
发帖数: 587 | 29 想对大概200bp的oligo template做in vitro transcription
我的目的就是，对oligo进行突变，比如一个A，一个C， 然后做IVT， 然后就简单的
nanodrop测量RNA yield；来观察A/C对transcription的影响
protocol上说对于short template，IVT可能有点困难。我想请问为啥呢？因为
polymerase很大，polymerase initiation需要一定的空间距离？而200bp太短？
我的目标并不是追求max yield，我的目标是比较A和C的yield区别。但是，因为200bp
长度太短，我不知道用200bp做IVT比较yield，是否严谨？ |
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r**********e
发帖数: 587 | 30 很感激
我做了200nt oligo为template的IVT，压根不work
而PCR product作为template还可以
我不知道是我技术的问题，还是oligo本来就很难work呢？ |
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m******u
发帖数: 12400 | 31 RNA polymerase一般需要双链template---assume大家用的是T7或SP6的polymerase。你
200nt template指的是单链模板么？至少promoter区要双链的。
而PCR产物则是双链的，你的问题会不会是这个原因。
发信人: reallyloveme (ray), 信区: Biology
标 题: Re: in vitro transcription for short template
发信站: BBS 未名空间站 (Tue Jun 20 12:46:24 2017, 美东)
很感激
我做了200nt oligo为template的IVT，压根不work
而PCR product作为template还可以
我不知道是我技术的问题，还是oligo本来就很难work呢？ |
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r**********e
发帖数: 587 | 32 现在要做一个实验：研究g－quadruplex对transcription的影响
我的设计大概是：
pcr product为template，加入kcl，95度，然后cool overnight；从而加强g－
quadruplex的结构
然后用上面的产物，做in vitro transcription，然后检测最后的rna yield
1. 不知道有没有这种做法的。
2. 我应该用多少pcr product作为template呢？
研究g－quadruplex一般用4-10uM的oligo，加入100mM kcl。。。貌似4-10uM的oligo大
概也是700ng/ul，我觉得我的pcr 产物都达不到这么高的浓度 |
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g*****x
发帖数: 3283 | 33 1)当然会反应，ACG在oligo合成时候分别用Bz, Ac和ib保护。除此之外，每一个ribose
的2'上的－OH也会反应。
2)这个修饰很显然得在rna oligo synth完成、脱保护/从CPG切割之前做，但很显然-
COOH的ester在随后用高浓度nucleophile脱保护/切除时就会被干掉。
3)综合以上两点，只在3'/5'做－COOH的ester基本上不可能。 |
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h********g
发帖数: 143 | 34 Thank you, Oligo.
I am also wondering whether it is necessary to spent 1 hr driving a day to
audit the course. I survived GaoKao but my English, speaking, reading and
writing, is not as decent as a native. I am trying to improve that by
reading more books and writing summaries.
I want to figure out what LS really looks like, even though I already know
LS is not like practicing law. I am attracted by law because of the
possibility to strengthen my way of thinking and change my career.
I guess you... 阅读全帖 |
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c*********d
发帖数: 9770 | 35 荒猫牛不耕微信号laoniu003005
功能介绍
好文分享
来源：荒猫之舞
作者：荒猫
中美贸易战告一段落，毫不意外地，咱们又赢了。不过与以往不同的是，这次美国也赢
了，是双赢。据报道，咱们答应了美国减少贸易逆差的要求，所以美国赢了；而因为要
减少贸易逆差，中方将大量增加自美购买商品和服务，这样可以满足咱们不断增长的消
费需求和促进高质量经济发展，所以咱们也赢了。
但让我感觉不可思议的是，这么好的事情，为什么一直不做呢？为什么要在美国政府的
逼迫下去做呢？是因为没有想到？那岂不是说那些人能力低下？是因为想到了而不做，
那岂不是证明了那些人很坏？
而且在美国高调启动贸易战之初，咱们是抱着多大的决心，宁为玉碎不为瓦全，一定要
打赢的，一定要粉碎美国人阻挡咱们大国崛起的阴谋的。当美国提出500亿的清单时，
咱们针锋相对；当美国提出1000亿的清单时，咱们继续应战；而当美国把清单的总价提
高到2000亿的时候，一夜之间，美国就不是阻挡咱们大国崛起，而是有利于咱们大国崛
起了。美国的要求原来是有利于咱们的发展，而不是遏制咱们的发展了。我恍然大悟：
原来以前的针锋相对，是用的激将法，是为了刺激美... 阅读全帖 |
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C*****h
发帖数: 926 | 36 他的技术，他自己都说了，就是用美国现在的基因编辑技术，方法和材料都是一样的。
他用的基因编辑的质粒，靶点设计，oligo分子合成等都是现成的，没有任何改进。 |
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x********e
发帖数: 35261 | 37 要个毛线的试剂盒啊。我早就研究过WHO官网上各国cdc检测的protocol，确定了哪个效
果最好。订几条oligo，隔天送到。其他试剂仪器都是现成。取样肛拭子，疑似病人自
己都能搞定。 |
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发帖数: 1 | 38 什么是肛柿子?
：要个毛线的试剂盒啊。我早就研究过WHO官网上各国cdc检测的protocol，确定了哪个
效果最好。订几条oligo，隔天送到。其他试剂仪器都是现成。取样肛拭子，疑似病人自
：己都能搞定。 |
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发帖数: 1 | 39 A fast growing Biotech company NJ is seeking a R&D Manager, position
available immediately, please send CV and cover letter to [email protected]/* */
com
Responsibilities:
1. Lead on R&D long-term strategic planning and innovation of new
technology platforms and product research
2. Responsible for annual planning, budgeting of the company's R & D
projects, including their organization and implementation, progress reports,
patent applications and industrial transformation of all rese... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 40 A fast growing Biotech company in NJ (Princeton area) is seeking an R&D
Manager, position available immediately, please send CV to
[email protected]
Responsibilities:
1. Lead on R&D long-term strategic planning and innovation
2. Lead on streamlining company’s DNA technology platforms and
production processes
3. Responsible for annual R & D planning and budgeting
4. Oversee patent applications and company intellectual property
portfolio building and expansion
5. Supervise... 阅读全帖 |
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s******y
发帖数: 28562 | 41 我以前的做法是找类似Genscript 这样的外包公司买几千块的voucher,然后慢慢用，反
正他们公司能做的事情很多，订抗体啦，oligo啦，蛋白纯化啦，都能做。 |
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发帖数: 1 | 42 A fast growing Biotech company NJ is seeking a R&D Manager, position
available immediately, please send CV and cover letter to [email protected]/* */
com
Responsibilities:
1. Lead on R&D long-term strategic planning and innovation of new
technology platforms and product research
2. Responsible for annual planning, budgeting of the company's R & D
projects, including their organization and implementation, progress reports,
patent applications and industrial transformation of all rese... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 43 A Biotech company in NJ is seeking a R&D Director, position
available immediately, work location: SuZhou China, please send CV to
[email protected]
岗位职责：
1. 负责参与制定公司新技术平台和新技术产品研发的长期战略规划并实施；
2. 负责公司研发项目的年度计划及预算、组织实施、进展汇报、专利申请与产业转化；
3. 负责公司研发团队的建设、培训、督导及激励，提升整体业务水平，营造积极的氛
围；
4. 负责了解行业发展趋势，洞悉市场需求变化，主持制定技术发展战略规划；
5. 负责与公司各业务部门沟通协调，保障研发部门对业务部门的技术支持。
任职资格：
1. 生命科学博士学位，最好是分子生物学，合成生物学或相关学科；
2. 具备五年以上生物技术企业的研发工作经验，有海外工作经历者优先；
3. 具备勇于探索的科研精神及孜孜不倦学习新知识的能力；
4. 具备创新思维能力、团队领导力及战略规划能力；
5. 具备良好的团队合作精神及敬业精神... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 44 A Biotech company in NJ is seeking a R&D Director, position
available immediately, work location: SuZhou China, please send CV to
[email protected]
岗位职责：
1. 负责参与制定公司新技术平台和新技术产品研发的长期战略规划并实施；
2. 负责公司研发项目的年度计划及预算、组织实施、进展汇报、专利申请与产业转化；
3. 负责公司研发团队的建设、培训、督导及激励，提升整体业务水平，营造积极的氛
围；
4. 负责了解行业发展趋势，洞悉市场需求变化，主持制定技术发展战略规划；
5. 负责与公司各业务部门沟通协调，保障研发部门对业务部门的技术支持。
任职资格：
1. 生命科学博士学位，最好是分子生物学，合成生物学或相关学科；
2. 具备五年以上生物技术企业的研发工作经验，有海外工作经历者优先；
3. 具备勇于探索的科研精神及孜孜不倦学习新知识的能力；
4. 具备创新思维能力、团队领导力及战略规划能力；
5. 具备良好的团队合作精神及敬业精神... 阅读全帖 |
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l*h
发帖数: 4124 | 45 every one was surprised. the senior pathologist said it was not the first
but very very rare. pilocytic astro, you'd expect most are in young adults
and children, even though it can occur anywhere, most are in infratentorial
compartment (mainly cerebellum), you'd expect cystic changes, with ring
enhancement on T1 with.
much more often, anaplastic astro/oligo cannot be well differentiated from
gbm on mri.
,
GBM, |
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d*p
发帖数: 534 | 46 现在合成150bp长度得oligo很正常，我原来也想过用overlap扩增合成长基因，但是怎
么避免非特异性扩增这个问题一直没有想到好的方法， 有机会可以交流 |
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t********o
发帖数: 287 | 47 Abstract:
We introduce a facile strategy to obtain dense 3-dimensional assembly of non
-functionalized gold nanoparticles into unmodified, end-tethered poly(oligo(
ethylene glycol) methacrylate) bottle brushes of high grafting densities.
Referred as ‘in-stacking’, we present its mechanism based on evidences
from UV-vis absorbance, AFM and FESEM.
请把你的研究背景，官方email，姓名和title发给我，我去向editor推荐你。
比较倾向于推荐目前只review过几篇的同学们，已经有十几篇以上在手的，你也不缺了。 |
|
r*f
发帖数: 39119 | 48 可能因为阳光太好，到处人都很多啊。
eaton centre里面尤其多。sears在送shiseido，不过礼物是benefiance的，打算
自己用的mm们可以不用考虑了。bay那个clinique送的不咋的，谁会没用过ddml呢。
传说holt renfrew的estee lauder买满60送，我在店门口没看见，懒得进去了。
倒是pharma plus在卖vichy的几种礼包，比如thermal fix 2送6个小东西，价钱和
thermal fix 2一样。oligo 25的大概33来着。
上次去bloor & bay的br，觉得店员有点狗眼，看见咱就拿一件试穿的那个表情啊。。。
切，其实我更喜欢eaton centre的那个店，昨天颇有些打折的，虽然折扣不是最最好，
有些还颇为不错的。。。。不过女装部的男sales persons实在gay到不能再gay了，
不开口我还以为是女的，芬特。。。。
跑到valumart买到半个la rocca的mixed fruits torte，上次带给别人一整个，俺
奋力塞也就吃下了一块。。。到家赶紧吆喝众人聚齐，分了吃了，这样才会在
观赏国 |
|
b****i
发帖数: 11322 | 49 let me bring out wiki, yet, again:
fructose absorption:
The mechanism of fructose absorption in the small intestine is not
completely understood. Some evidence suggests active transport, because
fructose uptake has been shown to occur against a concentration gradient.[23
] However, the majority of research supports the claim that fructose
absorption occurs on the mucosal membrane via facilitated transport
involving GLUT5 transport proteins. Since the concentration of fructose is
higher in the lu... 阅读全帖 |
|
s**c
发帖数: 34339 | 50 ☆─────────────────────────────────────☆
sioc (煎饼爱果子) 于 (Mon May 21 15:47:50 2012, 美东) 提到:
A组：1）波兰、2）希腊、3）俄罗斯、4）捷克
B组：1）荷兰、2）丹麦、3）德国、4）葡萄牙
C组：1）西班牙、2）意大利、3）爱尔兰、4）克罗地亚
D组：1）乌克兰、2）瑞典、3）法国、4）英格兰
请按各组分别写出晋级8强的两支球队和排名。
一个ID只能参与一次。
全对者200伪币，猜对3组者100伪币，2组50伪币，1组10伪币奖励。
首场比赛日截至，参与从速。
最终解释权归足球版版务所有，谢谢
示例：
A 捷克 波兰
B 德国 葡萄牙
C 西班牙 意大利
D 乌克兰 英格兰
即A组捷克第一名，波兰第二名，以此类推。
☆─────────────────────────────────────☆
Nehalem (Nehalem) 于 (Mon May 21 15:50:24 2012, 美东) 提到:
A组好水啊
☆────────────────────────────────... 阅读全帖 |
|
