s******y
发帖数: 28562 | 1 可是我们经常拿来做内参的tRNA也是有结构的呀，碰到RNase一样死得很快啊。
如果你放在一个超级干净的管子里当然没有问题，但是不就是怕污染么？但是DNA
oligo 就没有这个问题。放一个星期的说法我还是为了谨慎而这么说的，其实放几年都
没有问题。 |
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s*****i
发帖数: 315 | 2 我试了两次，没有做出来，完全用韩写的protocol做的，而且试过了分别转质粒和
oligo。正对照是CRISPR-Cas9, target 同一个 exon，所以做的Surveyor assay 没问
题。
质粒的转染效率有80%，因为共转了EGFP质粒并做了FACS。
也许是我手臭吧。有没有共转质粒和ssDNA比较好的protocol？ |
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r********s
发帖数: 149 | 3 我也试了一次，没做出来。现在准备用他们的gata4来做positive control.
[在 samalli (小米) 的大作中提到：]
:我试了两次，没有做出来，完全用韩写的protocol做的，而且试过了分别转质粒和
:oligo。正对照是CRISPR-Cas9, target 同一个 exon，所以做的Surveyor assay 没问
:题。
:质粒的转染效率有80%，因为共转了EGFP质粒并做了FACS。
:也许是我手臭吧。有没有共转质粒和ssDNA比较好的protocol？
:天下熙熙，皆为利来；天下攘攘，皆为利往。 |
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s*****i
发帖数: 315 | 4 又做了一次，没有成功。我认识有个公司的人（CRISPR高手）也在试，试了两次没有成
功，我们分别独立设计的质粒
质粒是 pcDNA3.1-Flag-SV40NLS-NgAgo. C端没有tag， N端跟韩paper的primer序列完
全一样
用了IDT的5'phopspho-G10，用了韩的条件，也用了号称可以共转oligo和plasmid DNA非
常牛的mirus x2
转了1/10的GFP plasmid，FACS的转染效率 Lipo 2000 40%~50%， X2 转染效率 90%
拿到了韩放到 addgene的质粒
下周再试一次 |
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j******i
发帖数: 939 | 5 不会真的有造假吧
From Google Group
------
Hi,
I tried a couple of transfections with the NgAgo plasmid from Addgene and
the 5'P oligo against GFP from the paper, but I did not see a dramatic
reduction in GFP+ as seen using Cas9 and a GFP sgRNA.
Anybody tried as well and came to the same (dead) end?
Davide
Hi, Davide,
I tried the same plasmid that you used to target DYRK1A, HBA2, GATA4, which
are tested in Han's paper, but I didn't see any indel as they did. It seems
there is something wrong with this sy... 阅读全帖 |
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Z******5
发帖数: 435 | 6 反转录的时候，如果random hexamer做引物，当它碰到另外一个模板上结合的hexamer
时候，就会自动终止。所以如果你是拿来做克隆的模板，最好单独用oligo dT做模板搞
出来的cDNA。如果非要用random hexamer，量要控制好，不要太多。 |
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A*******e
发帖数: 284 | 7 用Oligo dT反转录啊，random primer不适合做全长克隆 |
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s******y
发帖数: 28562 | 8 要用gene-specific primer. 可以用DNA oligo。 但是这个做法在我的经验里效率不高
（我怀疑那些公司瞎说）。
如果没有gene-specific primer，另外一种方法就是用5'-mRNA head structure 用烟
草病毒的一种酶来切掉之后再用RNA ligase来把一个已知序列的片断连上去，然后从那
个来扩增。 |
|
发帖数: 1 | 9 Hi,
I tried a couple of transfections with the NgAgo plasmid from Addgene and
the 5'P oligo against GFP from the paper, but I did not see a dramatic
reduction in GFP+ as seen using Cas9 and a GFP sgRNA.
Anybody tried as well and came to the same (dead) end?
Davide |
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发帖数: 1 | 10 发信人: samalli (小米), 信区: Biology
标 题: Re: 闊╂槬闆ㄧ殑NgAgo鏁堢巼鎬庝箞鏍凤紵鏈変汉璇曡繃涔堬紵
发信站: BBS 未名空间站 (Sat Jun 4 14:56:56 2016, 美东)
我试了两次，没有做出来，完全用韩写的protocol做的，而且试过了分别转质粒和
oligo。正对照是CRISPR-Cas9, target 同一个 exon，所以做的Surveyor assay 没问
题。
质粒的转染效率有80%，因为共转了EGFP质粒并做了FACS。
也许是我手臭吧。有没有共转质粒和ssDNA比较好的protocol？ |
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发帖数: 1 | 11 发信人: raindallas (Never give up), 信区: Biology
标 题: Re: 闊╂槬闆ㄧ殑NgAgo鏁堢巼鎬庝箞鏍凤紵鏈変汉璇曡繃涔堬紵
发信站: BBS 未名空间站 (Sat Jun 4 20:32:20 2016, 美东)
我也试了一次，没做出来。现在准备用他们的gata4来做positive control.
[在 samalli (小米) 的大作中提到：]
:我试了两次，没有做出来，完全用韩写的protocol做的，而且试过了分别转质粒和
:oligo。正对照是CRISPR-Cas9, target 同一个 exon，所以做的Surveyor assay 没问
:题。
:质粒的转染效率有80%，因为共转了EGFP质粒并做了FACS。
:也许是我手臭吧。有没有共转质粒和ssDNA比较好的protocol？
:天下熙熙，皆为利来；天下攘攘，皆为利往。 |
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发帖数: 1 | 12 发信人: samalli (小米), 信区: Biology
标 题: Re: 韩春雨的NgAgo效率怎么样？有人试过么？
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Jun 10 21:21:26 2016, 美东)
又做了一次，没有成功。我认识有个公司的人（CRISPR高手）也在试，试了两次没有成
功，我们分别独立设计的质粒
质粒是 pcDNA3.1-Flag-SV40NLS-NgAgo. C端没有tag， N端跟韩paper的primer序列完
全一样
用了IDT的5'phopspho-G10，用了韩的条件，也用了号称可以共转oligo和plasmid DNA非
常牛的mirus x2
转了1/10的GFP plasmid，FACS的转染效率 Lipo 2000 40%~50%， X2 转染效率 90%
拿到了韩放到 addgene的质粒
下周再试一次 |
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s******y
发帖数: 28562 | 13
这个目前不好下结论。但是如果最后发现原因真的在这里的话，那么有一种可能性是那
些没有磷酸化的oligo 起的是非竞争性的抑制作用，比方说一种可能性就是可能会把催
化位点给卡住让正常的底物无法结合上去。 |
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T*G
发帖数: 600 | 14 胖老师的眼光很毒阿，好想做出来的group都是用激酶做的，如果是这个原因也是挺奇
葩的。
“Hi guys,
We have used this system and it works. We have followed the same protocol as
mentioned in the paper and were able to confirm knockout both on FACS as
well as western. We purified the oligos on gel after T4 PNK and saw the
phenotype after 48 and 72 h.“
cheers
debo |
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发帖数: 1 | 15 这是重复的fig3c 这个国内也有实验室能做出来 而且只转gDNA也能看到轻微下调
fig4 测序看到切割是关键
[在 TSG (Now we are one!) 的大作中提到：]
:胖老师的眼光很毒阿，好想做出来的group都是用激酶做的，如果是这个原因也是挺奇
:葩的。
:“Hi guys,
:We have used this system and it works. We have followed the same protocol
as mentioned in the paper and were able to confirm knockout both on FACS as
:well as western. We purified the oligos on gel after T4 PNK and saw the
:phenotype after 48 and 72 h.“
:cheers
:debo |
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j******i
发帖数: 939 | 16 有人重复出来了
Hi guys,
We have used this system and it works. We have followed the same protocol as
mentioned in the paper and were able to confirm knockout both on FACS as
well as western. We purified the oligos on gel after T4 PNK and saw the
phenotype after 48 and 72 h.
cheers
debo |
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发帖数: 1 | 17 确保不是因为未被磷酸化的Oligo引起的RNAi,更正笔误
GFPknock- |
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f****t
发帖数: 22 | 18 其实我一直都没想明白，为什么别人用agarose和EB做的事情，到了NgAgo就要用PAGE和
银染。
银染定量及其不准，反应太快，太容易类似“过曝”，提高小概率事件的比例。
另外，单独转染oligo出现对应蛋白表达下降，难道不就是antisense effect？ |
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发帖数: 1 | 19 From Google 网上论坛
Michael Wilson
2016-07-15 16:54（1 分钟前）
将帖子翻译为中文
Hello,
We have twice attempted to test the NgAgO addgene plasmid in HEK 293 cells
using lipofectamine transfection and the EGXXFP split reporter assay. As
many are aware, this assay requires DNA cleavage in the EGXXFP plasmid to
restore GFP expression.
We ordered oligos with 5' phosphorylation and transfected directly or PNK-
treated an aliquot prior to transfection, just to ensure 5' phosphorylation;
neither of these methods ... 阅读全帖 |
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s*********y
发帖数: 292 | 20 我看到无数人在重复啊，至少没有一个说是能重复出来的
说来说去就是细胞污染，转染不好，oligo磷酸化要自己做，这不是扯淡么。CRISPR为
什么一做就能做出来？ |
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c********n
发帖数: 225 | 21 第四类“重复” 验证实验信息：实名, 网络、论坛发布
- 重复、拓展验证实验不能支持NgAgo基因组编辑功能
暂只收录包含有具体实验信息（eg实验材料，步骤，etc）的发布报告
第一则
- 发布方：Dr. Davide Seruggia
- 发布时间：2016年6月23日 至2016年7月20日
- 发布平台：google groups
- 发布方国家：美国
- 发布方城市：Boston
- 发布方研究机构：Boston Children's Hospital
- 实验室PI：Dr. Davide Seruggia
- NgAgo的来源：Addgene
- 重复及验证实验结果:
o 重复文章中的NgAgo/gDNA - GFP实验不成功 （对比实验Cas9 –“dramatic
reduction”）
o 拓展实验inject embryos - ”pups with no phenotype, no indels”
- 重复及验证详细信息: oligo来源及用量，实验简介，实验结果简汇
- 实验数据发... 阅读全帖 |
|
c********n
发帖数: 225 | 22 第四类“重复” 验证实验信息：实名, 网络、论坛发布
- 重复、拓展验证实验不能支持NgAgo基因组编辑功能
- 包含有具体实验信息（eg实验材料，步骤，etc）以及发布方具体信
息的发布报告
- 需包含发布时间
- 建议注明是否应用2016年8月8日韩春雨组在Addgene更新的Protocol的相关条件
信息简述：
- 发布方：Dr Gaetan Burgio*
- 发布时间：2016年8月26日
- 发布平台：twitter，medium.com
- 发布方国家：澳洲 Australia
- 发布方城市：Canberra
- 发布方研究机构：JCSMR，ANU College of Medicine, Biology and Environment
- 实验室PI：Dr Gaetan Burgio
- NgAgo的来源：Addgene
- 应用验证实验结果: 无法验证韩春雨NgAgo基因编辑的实验结果
作者特别声明
1.是在“mouse zygote”系统应用的NgAgo，是作者实验室非常熟悉的系统，无... 阅读全帖 |
|
c********n
发帖数: 225 | 23 第四类“重复” 验证实验信息：实名, 网络、论坛发布
- 重复、拓展验证实验不能支持NgAgo基因组编辑功能
暂只收录包含有具体实验信息（eg实验材料，步骤，etc）的发布报告
第一则
- 发布方：Dr. Davide Seruggia
- 发布时间：2016年6月23日 至2016年7月20日
- 发布平台：google groups
- 发布方国家：美国
- 发布方城市：Boston
- 发布方研究机构：Boston Children's Hospital
- 实验室PI：Dr. Davide Seruggia
- NgAgo的来源：Addgene
- 重复及验证实验结果:
o 重复文章中的NgAgo/gDNA - GFP实验不成功 （对比实验Cas9 –“dramatic
reduction”）
o 拓展实验inject embryos - ”pups with no phenotype, no indels”
- 重复及验证详细信息: oligo来源及用量，实验简介，实验结果简汇
- 实验数据发... 阅读全帖 |
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c********n
发帖数: 225 | 24 第四类“重复” 验证实验信息：实名, 网络、论坛发布
- 重复、拓展验证实验不能支持NgAgo基因组编辑功能
- 包含有具体实验信息（eg实验材料，步骤，etc）以及发布方具体信
息的发布报告
- 需包含发布时间
- 建议注明是否应用2016年8月8日韩春雨组在Addgene更新的Protocol的相关条件
信息简述：
- 发布方：Dr Gaetan Burgio*
- 发布时间：2016年8月26日
- 发布平台：twitter，medium.com
- 发布方国家：澳洲 Australia
- 发布方城市：Canberra
- 发布方研究机构：JCSMR，ANU College of Medicine, Biology and Environment
- 实验室PI：Dr Gaetan Burgio
- NgAgo的来源：Addgene
- 应用验证实验结果: 无法验证韩春雨NgAgo基因编辑的实验结果
作者特别声明
1.是在“mouse zygote”系统应用的NgAgo，是作者实验室非常熟悉的系统，无... 阅读全帖 |
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m****a
发帖数: 270 | 25 你这相当于要KI两个不同长片断来筛选biallelic mutation
感觉技术上可行，不是这方面的专家，我就说一点我个人的一点点看法
1. 编辑的效率比利用ssDNA oligo 作为Donor 低不少。
2. 两个位点同时KI GFP或者RFP这两种情况被排除掉了也进一步降低了效率
3. 要克隆和转染的质粒有点儿多，实验上操作有点复杂。 |
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w*p
发帖数: 16484 | 26 因为他没啥别的好挑刺了。
以前他说oligo要自己做磷酸化，又说Mg离子浓度很关键，这两个人家都特别注意了。
剩下能挑的只有细胞污染了。
如果证明了细胞没有污染，我看韩春雨下次可以说河北和浙江的重力加速度不一样，所
以全世界只有在河北科技大学才做的出来。 |
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发帖数: 1 | 27 我看了半天没有找到，这些人做课题水平真不咋的。这么重要的对照组不做，或者是故
意隐瞒，有这个对照组就表明磷酸化ssDNA oligo knockdown mRNA是NgAgo
independent的 |
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发帖数: 1 | 28 磷酸化的ssDNA oligo是不是能够被其他的argonaute招募去降解特异mRNA呢？ 如果能
，有个屁的意义啊 |
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g*****n
发帖数: 250 | 29 DNA 结合 RNA 不仅理论上说得通，而且实际上可行。听说过antisense oligo吧？都做
过临床实验的。韩国的东西就是一个antisense实验，有没有NgAgo都没关系。跟韩春雨
的基因编辑没有半分钱关系。 |
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x**********o
发帖数: 142 | 30 不好意思，貌似antisense oligo 在是反义DNA的情况下，多数是与DNA正链序列互补的
，而反义RNA是作用于mRNA的
在 ganggan (ganggan) 的大作中提到: 】 |
|
发帖数: 1 | 31 A fast growing Biotech company NJ is seeking a R&D Manager, position
available immediately, please send CV and cover letter to [email protected]/* */
com
Responsibilities:
1. Lead on R&D long-term strategic planning and innovation of new
technology platforms and product research
2. Responsible for annual planning, budgeting of the company's R & D
projects, including their organization and implementation, progress reports,
patent applications and industrial transformation of all rese... 阅读全帖 |
|
g*****x
发帖数: 3283 | 32 当然有办法，合成RNA oligo的时候加一些modification即可
可惜我不能告诉你细节哈哈
解。 |
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发帖数: 1 | 33 A fast growing Biotech company NJ is seeking a R&D Manager, position
available immediately, please send CV and cover letter to [email protected]/* */
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1. Lead on R&D long-term strategic planning and innovation of new
technology platforms and product research
2. Responsible for annual planning, budgeting of the company's R & D
projects, including their organization and implementation, progress reports,
patent applications and industrial transformation of all rese... 阅读全帖 |
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m********o
发帖数: 98 | 34 这例子举的。。。NGS代替显微镜早就是多少年的趋势了，层主转行多久了？一个技术
当然不能完全代替另一个技术，这不废话吗？ngs回答的问题有限，ms就无限？还是ms
比ngs更不“非常”局限？话说的像本科生还没开始读一样。。。蛋白相互作用又怎样
，抗体上conjugate点DNA oligo看相互作用+quantification的技术早都不新鲜了，怎
么就跟ngs毫无关系了？
楼主问的是哪个发展好，ms去industry确实很好，因为不像ngs那样会的人越来越多，
人人都可以称自己做过ngs，但是ms学术圈的话可能圈子也小一点 |
|
发帖数: 1 | 35 A fast growing Biotech company in NJ (Princeton area) is seeking an R&D
Manager, position available immediately, please send CV to
[email protected]
Responsibilities:
1. Lead on R&D long-term strategic planning and innovation
2. Lead on streamlining company’s DNA technology platforms and
production processes
3. Responsible for annual R & D planning and budgeting
4. Oversee patent applications and company intellectual property
portfolio building and expansion
5. Supervise... 阅读全帖 |
|
r**********e
发帖数: 587 | 36 对照组的话，我是比较不同长度的G4，比如5个G4和10个G4的区别
RNA yield，我就是In vitro transcription，然后用bio-spin column purify RNA，
去除比如single nucleotide；然后直接nano-drop来测量。不知道nanodrop行不行？
另外，关于初始浓度
文献上是30nt的oligo，用100mM KCL 稀释成4uM；
而我的pcr 产物有300nt，那么是不是使用的浓度直接是 （30nt * 4uM）/ 300nt = 0.
4uM就可以了？
也就是，我的pcr 产物直接用100mM KCL稀释成0.4uM？
换句话说，还是看最后的质量浓度 ng/ul ？长度长的template，molecular weight大
，需要的摩尔浓度低
关键是，我不知道如何搭配DNA vs KCL的浓度，来获得一个induce g-quadruplex最好
的环境，所以只能根据已有的文献进行换算 |
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发帖数: 1 | 37 A fast growing Biotech company in NJ (Princeton area) is seeking an R&D
Manager, position available immediately, please send CV to
[email protected]
Responsibilities:
1. Lead on R&D long-term strategic planning and innovation
2. Lead on streamlining company’s DNA technology platforms and
production processes
3. Responsible for annual R & D planning and budgeting
4. Oversee patent applications and company intellectual property
portfolio building and expansion
5. Supervise... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 38 A fast growing Biotech company in NJ (Princeton area) is seeking an R&D
Manager, position available immediately, please send CV to
[email protected]
Responsibilities:
1. Lead on R&D long-term strategic planning and
innovation
2. Lead on streamlining company’s DNA technology
platforms and
production processes
3. Responsible for annual R & D planning and
budgeting
4. Oversee patent applications and company
intellectual property
portfolio building and expansion
5. Supervise... 阅读全帖 |
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g***0
发帖数: 436 | 40 这个位置很危险哦
玩oligo synthesis用的都是很毒的东东～
不过走投无路的时候我还是会申一下～ |
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g***0
发帖数: 436 | 41 偶尔做一做没啥
看那个job，应该是要整天合成oligo
我们lab的那个DNA synthesizer一股味，特别是清废液的时候
前一段不是有个女的倒DMF然后挂了吗 |
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P*********e
发帖数: 26 | 42 在玻璃和Oligo之间引入一定长度的PEG，会在一定程度上降低non-specific binding. |
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e****2
发帖数: 2723 | 43 其实都是夸张
PHIl BARAN 的最近合成的那个OLIGO INDOLE 真没啥稀奇
不懂为啥发了这么多JACS
我请他收我当薄厚， 竟然被拒，真不懂 |
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e****2
发帖数: 2723 | 44 其实都是夸张
PHIl BARAN 的最近合成的那个OLIGO INDOLE 真没啥稀奇
不懂为啥发了这么多JACS
我请他收我当薄厚， 竟然被拒，真不懂 |
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A******y
发帖数: 2041 | 45 The extinction coefficient is different right? Like I said, I haven't
determine DNA concentration for awhile. Also, the cost of those greens will
probably be more than just order the ds oligo from IDT again.
signal
designed |
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a**********6
发帖数: 336 | 46 个人经验click会效率好一点，其实两个都不错
amicon的spin filter有30k,50k, 100k，随便选一个就行吧 |
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y****6
发帖数: 196 | 47 多谢。
我想用的DBCO/Azide pair （Cu-free）和 Cu 催化的click 反应效率要差一些，但是
不知道差多少，哪位有经验吗？
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 1.0.1 |
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y****6
发帖数: 196 | 49 再次感谢
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7 |
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f*******e
发帖数: 628 | 50 啥叫 qualify? 干什么用？
定量 oligo 的话，qbit 之类的 fluorescence 很准确，应该也不受 enzyme 的影响。
不怕麻烦的话，fluorometer 之类仪器加 staining dye 也可。
HPLC, ... 也行吧。跑个胶也行。用什么方法取决于你有多大量的 sample。 |
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