i*****i
发帖数: 154 | 1 Just order shRNA from Sigma.
5 clones for $300, much cheaper than order oligos from IDT. |
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s**2
发帖数: 1287 | 2 order two oligos (add overhangs for ligation),
mix at 1:1 molar ratio,
boil,
cool down slowly to anneal,
ligate with your cut vector. |
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z*********3
发帖数: 335 | 3 I used to order from Sigma (100 to 150 bp), PAGE purified grade, and ask
Sigma to provide the PAGE gel picture for show the quality of the oligo.
Normally, <60 bp is purified by desalt column. HPLC comes between 60 to 100.
PAGE is the best for >100 bp. IMO. |
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c****g
发帖数: 93 | 5 你有空发文没空看Feng的网页么？一切信息都在那里。 |
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o**4
发帖数: 35028 | 6 看了啊，似乎是不用加吧，
但是网页上没有说的很明确 |
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r********s
发帖数: 149 | 7 不用加，20bp加上4bp overhang.cloned into pX330
有没有人知道那些数字是什么意思？数字越大越specific or more efficient? |
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c****g
发帖数: 93 | 10 你有空发文没空看Feng的网页么？一切信息都在那里。 |
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o**4
发帖数: 35028 | 11 看了啊，似乎是不用加吧，
但是网页上没有说的很明确 |
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v********e
发帖数: 1597 | 14 给我个email我把怎么设计和构建的protocol发给你，我用的pSpCas9-BB 和pLenti-
CRIPSR V2, addgene 有，适用于这个protocol |
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i***l
发帖数: 1656 | 18 nothing or smear, i guess |
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q********i
发帖数: 27 | 19 应该啥也看不到吧，mRNA只占很小的部分在total RNA中。看你用啥反转录酶，一般几k
应该没有问题。 |
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Z******5
发帖数: 435 | 21 invitrogen的superscript3 kit中的反应时间是40min，说明书中说4kb以内的片段都没
问题。 我之前有做过13kb的，延伸2个小时，也能搞定。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 22 Agilent @AffinityScript Multiplec trmprature Reverse Transcriptase could be
up to 20 kbp
Pls chrck below pdf file, its Top one line,
HTTP double dot//www.laborjournal.de/rubric/produkte/products_09/LJPr-09-07.
pdf |
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f*********9
发帖数: 258 | 23 用crispr／cas9
给这个蛋白的chr上加个tag然后做RNA IP
或者用biotin label 的oligo pulldown RNA 核protein 做protein seq |
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r**a
发帖数: 121 | 24 谢谢各位的建议。
目前，我们还不准备做RNA-seq,觉得耗费是不是太大了
我们第一步，只是想证明这个是RNA binding的蛋白
我们目前有一个myc tag的蛋白，在转在果蝇里面（我们是做果蝇的），而且是
functional的，所以可以用这个抗体，但是在果蝇里面好象没有好的办法标记RNA （我
不知道能不能尝试，用oligo dT的beads，pulldown，能不能拉下我的蛋白？）
还有一个，我们已经在那个HTH motif做了点突变，有几个突变体有很好的现象，
所以我们还想进一步证明，这个作用是通过这个区域进行的。
所以，只要是一个体外的实验，证明上面两点就可以了。
midwestPhD大哥的方法不错，就是我个人对这个EMSA有点怵（听说挺麻烦的），以前硕
士的时候帮一个师兄一起搞过，没有做出来。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 25 用GFP UV-corissing immunoprecipitated mRNAs assay
pls refer,
>
GFP-Based Method for Detection of mRNA-Protein Interactions
HeLa cells expressing N- or C-terminally EGFP/YFP-tagged proteins (Table S7)
were induced with tetracycline, irradiated with UV light, and lysed. GFP-
binding protein (GBP; GFP agarose trap, Chromotek)-immunoprecipitated mRNAs
were detected using an oligo(dT)25 probe fused to TRed dye (Sigma).
RNAs coimmunoprecipitated with GFP/YFP-tagged proteins were identified by
RNASeq. D... 阅读全帖 |
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b******k
发帖数: 2321 | 26 antisense oligo倒是批了几个药
虽然都是很小众的药，但是他家pipeline里颇有几个号称要blockbuster的。。 |
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b******k
发帖数: 2321 | 27 antisense oligo倒是批了几个药
虽然都是很小众的药，但是他家pipeline里颇有几个号称要blockbuster的。。 |
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f*******e
发帖数: 628 | 29 IDT 的 synthesis, 100nmol 的 scale 不是 guaranteed yield， 特别是如果你选了
比较严格的纯化。
5 |
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j******i
发帖数: 939 | 30 ZFN, TALEN, CRISPR我都在用。挑最喜欢的，还是ZFN，因为他小，很容易放到viral
vector里边。但是它贵啊，自己合成的话，成功率又不高。TALEN克隆费力了一点，不
过熟练的话，一周就能拿到了。CRISPR定oligo, 克隆，怎么也要一周了吧。TALEN的专
一性很好，CRISPR的潜在off-targets一搜能搜出一大堆，吓死人。
shRNA是RNA识别RNA, CRISPR是RNA识别DNA+cas9识别DNA, 所以你不能简单的说都是RNA
guide. Cas9没有gRNA就没有办法cut on target了。当然，不知道cas9本身有没有细
胞毒性。 |
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l********e
发帖数: 415 | 31 这是个有意思的问题.
RNA反转录以后, 建library以前, 是必须超声打碎到150-300bp的小片段
所以,理论上说,部分降解的RNA是完全不影响测序的.
但是实际中应该有些细节要考虑,比如不能用oligo dt反转录或者polyA enrichment.
因为这样做出来的library会丢失所有没有polyA的片断.
市面上有用random primer建库的kit (比如Nugen). 因为是病人样本, 只要不是完全降
解, 值得尝试. |
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s******y
发帖数: 28562 | 32 关键看看内参的差别有多大。如果内参的量做出来差别不超过四倍的话我觉得是可以用
的。
另外，反转录起始的RNA量说明不了什么的，因为很多都是不能被oligo-dT反转录的东
西(rRNA,tRNA, etc.)。 |
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K**R
发帖数: 193 | 33
你觉得用oligo dt 好还是random primer好呢？ |
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d********6
发帖数: 76 | 34 HPLC分离30个base以上的oligo就没有什么分辨率了。用PAGE吧。如果你们实验室自己
有固相合成仪的话，用trity-on mode，脱保护以后HPLC分一遍，然后酸切掉DMT，HPLC
再分一遍，就很纯了 |
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l****5
发帖数: 1 | 35 在哪个公司 可以买到 2'-5' oligo A？ 看了些paper，他们都是自己实验室合成的，
很麻烦。。就想 买一点用，不知那个公司可以买到？ sigma好像没有。。谢谢。。 |
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l*********i
发帖数: 332 | 36 ssDNA oligo as donor, puro screen, should be easy~ |
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m*********D
发帖数: 1727 | 37 是。我还没开始设计了。万一guide RNA的点离replace的点太远的话，Homology-
directed template是直接合成呢还是需要克隆还是问题呢。现在Oligo合成能达到什么
样的长度？IDT合成150 base有问题吗？PAGE的纯花肯定让他们作了。度多少年不作这
些基础试验了。 |
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b******9
发帖数: 102 | 38 看你是用什么载体，有直接将oligo退火然后GoldenGate克隆的（比如张峰lab的）；也
有把整个U6 expression cassette 通过overlap PCR 或者 Gibson 拼起来插到载体里
的（比如Church lab） |
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y****6
发帖数: 196 | 39 自己顶一下
15kD
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 1.0.1 |
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s******r
发帖数: 1245 | 40 要做精确mutation的必须用donor，可以用oligo或者plasmid，跟crispr vector没太大
关系，crispr只负责切断DNA，之后的是同源重组，protocol去找别人已经发表的最好
是在你要用的cell type里做成功的
There
be |
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k****l
发帖数: 279 | 41 做construct，要切的地方没有合适的内切酶
想用NEB的 Cas9 做体外的 CRISPR来切质粒，需要sgRNA，网页上建议做 in vitro
transcription
不知化学合成 sgRNA oligo 是否可行，会有folding 方面的问题吗？
谢谢大家！ |
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x********e
发帖数: 35261 | 42 我扫了一眼paper没搞懂啊。如果本身是环状RNA跟质粒结构一样的话，怎么做RT-PCR？
他们RT-PCR还用oligo dT做引物呢。就算是环状用随机引物RT也会变线性吧？ |
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x********e
发帖数: 35261 | 43 问题是method里说RT用的是随机引物或者oligo dT,这能转录出环状cDNA? 用环状cDNA
做qPCR我能理解。
either |
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r******g
发帖数: 600 | 44 293T 不是有10-20%么？
是Church的paper里面么，有写啊
直接做CRISPR以后，然后 理论上做单细胞克隆，筛就能筛出来吧
只不过有点儿laborious
难道我理解错了？
我自己没做过，但是仔细研究过做过的protocol，nucleotide-to-nucleotide的比较
之前有个哥们人回帖说，homology arm要很长的，crispr的DNA oligo的homology arm
不需要很长 |
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t*******w
发帖数: 107 | 45 very neat work~
28/54 successfully spliced
4/28 successfully recombined using ssDNA oligos.
basically, only 4/54 (7.4%) worked for the purpose of therapeutics in
treating Beta-thal.
Considering that 2 off-target sites were founded in 6 samples by exome seq,
the odds to select a healthy (not considering non-coding region mutation)
working embryo is less than 1.5%~.
The therapeutic value in treating inborn error is none in a forseeable
future. But it is a very strong tool in animal gene editing.
A... 阅读全帖 |
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x*****e
发帖数: 309 | 46 我现在刚达到这种境界，得益于q5,phusion 酶，退火温度为Tm+3，长引物（〉23），
高退火温度（〉60），可以应付大部分的要求了，现在我也很少用软件了。偶尔用一下
Oligo 7,好像是Java写的， 应该可以跨平台，推荐！ |
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n***w
发帖数: 2405 | 47 一般就直接拉一段序列，然后去idt oligo analyzer上看一下gc和tm，差不多的话就订
了，一般都能work |
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i***l
发帖数: 1656 | 48 楼上都对，
可能是蛋白有修饰
或者寡聚了
如果怀疑磷酸话，用磷酸酶消化，比较前后变化来证明； 怀疑糖基化，就用糖基酶处
理，处理前后跑胶比较。
但是一般糖基化的也不会100%，我做O LinK的糖基化，大多是其中一条本身的带，另一
条大些的糖基划的带；好像磷酸化也是一条本身大小的，一条或几条磷酸化的带，取决
于到底几个磷酸化位点，效率多少。
OLIGOER的问题 在高温下，穿膜区有非特异性疏水作用，导致聚合。这时候反而37度变
性更好。
但是，感觉从你描述来看，这个不太像，一般寡居的蛋白会形成Ladder，单体
，二聚，四聚，等等，不只两条带。 |
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j******i
发帖数: 939 | 49 RNP转干细胞就是用暴力啊（电转）基本上一半细胞会挂掉 剩下的细胞有没有伤残还不
好说 我看不出NgAgo在ki和ko上比Cas9有什么优势 至于pam ngg到处都是 而且cas9的
pam也是可以改变的 至于脱靶 NgAgo还需要接受更严格的检验 而且现在已经有改进版
本的Cas9了 号称没有脱靶 NgAgo在GC rich地方确实有优势
外源的dna有插入到基因组的风险 小片段的几率还大一点 这可能跟细胞自发的双链断
裂有关 具体说明原理不大清楚 5‘P oligo是不是特殊还没有证据 试想 如果用来做基
因治疗 这些gDNA搞不好就被整合到基因组离去了 这不是一件很可怕的事情吗
可能超乎你的想象 Sangamo现在在做一件事情就是直接把zfn deliver到肝治疗血友病
行不行的通 临床数据说话 基因治疗总体还是在摸索阶段 各种方法都该试试 说不定行
得通呢
zfn设计的好脱靶率可以很低 即使有脱靶 不在重要基因上就问题不大 zf结构在细胞中
普遍存在 而无论Cas9或者NgAgo用到临床上都有被免疫系统清除的风险 当然 用作基础
研究zfn／talen已经被淘汰了
'- |
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s******y
发帖数: 28562 | 50
"rna的特异性／稳定性应该也是比ss－5p－dna好的" ???
这个你恐怕是搞错了吧？ gDNA 就是长度２０多的"ss－5p－dna"，说穿了其实就是５
端磷酸化的oligo primer。这个东西稳定得一塌糊涂，在室温下放上几个星期都妥妥的
，但是我可是不敢这么放RNA的。
这个方法的优点就是gDNA 可以直接合成，而且很稳定，对于不用病毒的体外瞬转非常
合适。但是对于gRNA, 这么搞就很麻烦，首先是因为环境中到处都是RNase，连培养基
的血清里都有很多RNase，我虽然没有亲自做过这个实验，但是可以猜想到这个肯定需
要很小心的清洗。
当然缺点就是这个gDNA东西很难直接用病毒来当载体。虽然也有酶是可以合成单链DNA
的，但是不能合成那么短的一个片段。 所以我觉得这两者的优缺点正好是互补的，
gDNA 更适合混合蛋白酶来一起瞬转，gRNA适合用病毒载体来用质粒转。 |
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