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w******e
发帖数: 1187 | 2 didn't know that's an option... do you know how much would it cost? is it
possible to delineate all the hundreds of different sequences together?
all of them are made of ATCG, so I would guess different sequence could
have the same mass but different sequence?
thx! |
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w******e
发帖数: 1187 | 3 I don't know how to do PCR in this case, as I have 0 idea what the sequence
is (so no primer available on either end).
I meant to use the random primer to do one round of primer extension. Maybe
I can add some tag to the random primer to enable PCR? any thoughts? |
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s******y
发帖数: 28562 | 4 可以啊，小菜一碟。
就做microsequencing 好了。告诉他们有几个基团有可能被biotinylated,
让他们search database 的时候记得加上那个option |
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s******y
发帖数: 28562 | 5 可以，用microsequencing 完全可以。那个是他们的基本技术之一。
具体让质谱的人来说吧。 |
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w******e
发帖数: 1187 | 6 thx a lot!! you are the best~ |
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R****n
发帖数: 708 | 7 If you can remove the biotinylated group, you can build a miRNA library for the 2nd generation sequencing system.
then |
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e**r
发帖数: 1144 | 8 就算每条oligo准确率99%
拼接一两K最后也大部分都是有错误的啊
最后是测序去筛选吗？ |
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n********k
发帖数: 2818 | 9 completely dry, right? What could happen to it? IDT sends out the RNA oligo
this way all the time...I think it is pretty safe with pure organ solvent
or dry at RT for long time...otherwise, it would be problematic when we dry
the RNA at the end of Trizol protocol, right?
题, |
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R****n
发帖数: 708 | 10 Generally speaking adaptor and primer are all oligo nucleotide sequences.
The difference lies in their roles in a 2nd generation sequencing reaction.
Adaptor is used for ligating the primer to the target sequences(usually for
DNA,RNA,miRs).Certain sequences are more efficient for ligation reaction.
Sometimes there will be a barcode sequences between adaptor and primer to
identify each sample when multiple samples are sequenced.common primer pair
is used for amplify a huge pool of ligated sequenc... 阅读全帖 |
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w******n
发帖数: 767 | 11 没啥讲究吧，只不过用不着random了。我有时检测多个gene，用oligo(dt),做完反转录
，取RT产物可以检多个gene，没有问题。
primer |
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w******n
发帖数: 767 | 12 用的就是one step kit，我的kit是先45分钟，然后正常pcr cycle, 这45分钟就是在RT
,所以我用oligo dt到这一步就停下，后面用这个做模板pcr.加random应该没问题，我
一次加过两种引物。试一下就行，也不费劲，不过你的没有条带，不一定是这个原因。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 13 OMG
LZ used degenerated primer for cDNA single strand synthesis
R U Seriously? an amateur molecular biologist LZ?
Please go to
//www.protocol-
online.org/prot/Molecular_Biology/RNA/Reverse_Transcription__RT____cDNA_Synthesis/index.html
RT reaction is also called first strand cDNA synthesis. Three types of primers can be used for RT reaction:
oligo (dT) primers, random (hexamer) primers and gene specific primers with each having its pros and cons.
or
/media.affymetrix.com/support/technical/usb... 阅读全帖 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 14 from his/her sentence
>做realtime RTPCR， 自己上网设计的引物 mRNA as template 用one step RTPCR, then 自己上网设计的引物 PCR
竟
然一点不能得到产物
but with direct genomic DNA as template 自己上网设计的引物 可以得到很干净的条带
then you can IMAGE that---
because he/she did not have the full 3' UTR end that target full sequence information
so he/she used degenerated primer+oligo T tails for one-step qRTPCR
otherwise without below his/her 0F paste.
---- |
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w******n
发帖数: 767 | 15 one step rt-pcr用的就是 gene specific primer RT,说明书里通常说不推荐用random
或oligo(dt).
活,再开始PCR的cycle. |
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h*******o
发帖数: 4884 | 16 了解了
原来我一直以为one step RT-PCR的master mix里面有oligo dT之类,用来做RT step
然后user 自己加入的gene specific primer只是用来扩增用的
hoho, 傻兮兮的用了好几年都不知道原理
谢谢!
random |
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l**********1
发帖数: 5204 | 17 Your original thought is regular 3' RACE
oligo dT its target is poly (A) tail
but for super long 3' UTR (over 3 kp) mRNA that regular 3' RACE does not work
from even you do not know the extension time for that PCR before your did
Northern Blotting or similar experiment for knowing the full length of 3' UTR region. |
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s*******t
发帖数: 7746 | 18 试试antisense morpholino oligo ,发育学斑马鱼等都用morpholino同时knock down几
个基因 |
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m*****n
发帖数: 760 | 19 I used to order ~200bp, which cost me more than $100.
how did you get $99 for a 500bp oligo?
it would be great if you could share the experience. thanks |
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l**********1
发帖数: 5204 | 20 From our experience:
3’RACE does not need special kit.
only need special oligo d(T)n anchor poly(A)n tail primer design.
please go to
http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31635707.html
13th and 14th floor
and for 5’RACE we used below:
//catalog.takara-bio.co.jp/en/product/basic_info.asp?unitid=U100005358
//catalog.takara-bio.co.jp/en/product/ref_info.asp?unitid=U100005358
PDF document link:
//catalog.takara-bio.co.jp/en/PDFFiles/6122_e.pdf |
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b******y
发帖数: 627 | 21 I guess you can get ribosome+mRNA and then oligo-(dT). |
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b******y
发帖数: 627 | 22 It turns out that our lab use for AMO transformation into all kinds of
mammalian cell lines. It works much better than lipid-based methods.
Not sure about other types of oligos. Sorry. |
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b**********8
发帖数: 349 | 24 谢谢楼上各位的关注，再贴一个Plenti lox3.7这个vector自己的mannual，里面也建议
在poly T之前要加一个互补的C的。看来不同的vector要求不同，我已经把oligo发出去
了，一下子设计了5对shRNA，希望回来都能work，否则老板的脸又要黑了。 |
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b**********8
发帖数: 349 | 25 谢谢关注，我们是参考公司网站公布的序列自己订的oligo回来退火克隆的， |
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S*********s
发帖数: 304 | 26 一般至少要3 different oligos才能自己放心
siRNA的off target是非常严重的
最严谨的是shRNA KD,然后rescue with ectopic expression
shRNA也需要2-3个independent clone to exclude clonal effect |
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g*********5
发帖数: 2533 | 27 I used 7 oligoes on one gene... |
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a***e
发帖数: 1010 | 28 you can even use oligoes |
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l**********1
发帖数: 5204 | 29 Off-target 中奖拉 搂住的那单locus siRNA
还是考古下上个月的 旧贴 如何
同主题阅读：现在发文章还需要2套siRNA吗？
[版面:生物学][首篇作者：CAMS] , 2012年06月19日
answer:
一般至少要3 different oligos才能自己放心
siRNA的off target是非常严重的
最严谨的是shRNA KD,然后rescue with ectopic expression
shRNA也需要2-3个independent clone to exclude clonal effect
http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31683985.html
knockdown |
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E*********s
发帖数: 93 | 30 我用oligo synthsize 2nd strand. 但是合成后如何才能区别dsDNA 和ssDNA？ 最好是
哪个gel staining reagent 可以直接通过跑gel 就可以知道。谢谢。 |
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b******i
发帖数: 287 | 31 真是个大好人啊给了这么详细的回复！！！
我觉得能排除cDNA的质量问题，是因为我用同一批的cDNA去做PCR是可以PCR到从ATG到
下游的1.7K片段（其实还没有拿到全长，做出了5RACE，知道了转录起始位点，而CDS全
长2.5K，我设计了很多引物，目前只能拿到1.7K的序列，后面的800bp 怎么尝试都P不
出来，而3'RACE目前也还在努力中），所以我觉得OLIGO DT引物反转录出来的cDNA应该
没有问题吧，5'端ATG部分的序列都有了，那肯定是从3'端走过来的拉，应该走通了啊
。。。。。。 可是为啥就P不出来呢？
或者我应该尝试一下你说的这个RLM KIT，提高cDNA的质量试试！
非常感谢你花时间帮忙解决我的问题！ |
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z******5
发帖数: 30 | 32 弱弱的问一下 从公司order的siRNA是双链还是单链？
是否可以从公司(如IDT)直接order RNA oligos 做siRNA用？
顺便问一下使用pLKO.1做knockdown时如果选择的shRNA序列少于21bp (如19bp)， 是否
work?有没有载体可以选择较短的shRNA？
多谢。 |
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w********r
发帖数: 1431 | 33 双链。直接订RNA oligos可能不成，据说siRNA上面还会加有一些修饰，
siRNA末端不同的公司也会加两个dT还是dA什么的，可以参考各家公司订货的说明。
siRNA是否管用和长度没啥太大的关系，我们一般去Whitehead设计siRNA的网站上设计
三个，总有可以用的 |
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B***e
发帖数: 46 | 34 最近screen了一些siRNA, 打算重复一下positive的results，发现Dharmacon 一个
siRNA还挺贵的，有哪家公司的性价比比较好吗？
多谢了。 |
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s******s
发帖数: 13035 | 36 2000不算很少。我们实验室的技术员说，不能用column这类东西，纯化的时候
要用oligo dT的beads防止丢失。好像其他的步骤都差不多。我只知道这么多了 |
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j******i
发帖数: 939 | 37 TALEN之前的ZFN已经可以做到定点修饰了 差不多有十年了吧 但是 没火起来 因为zfn
巨难设计 一个repeat识别三个bases 但是 对应性很差 成功率很低 普通实验室根本耗
不起时间 sigma虽有卖 但是一对一万人刀吧 买不起 买了也不是百分百能用 talen才
出现几年 但是因为容易设计 一个repeat识别一个base 对应性很好 自己addgene买个
kit就能鼓捣了 一个星期就能拿到一对有效的talen 当然 那是得有相当经验的人
crispr的文章去年才出来了 敏感的人去年就意识到这个东西厉害了 现在 也不算晚 拿
来放到自己的project里 应该还能发好文章 crispr厉害的地方只要合成20个bases的
oligo就够了－当然为了方便克隆还是两头要加一些东西的 这太逆天了 比较明显的缺
点就是只能识别23个bases 更多缺点还有待发现 |
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q*****d
发帖数: 445 | 38 这篇文章的方法我怎么看不明白呢？如果我看明白了，就是它有明显的错误，但我相信
NBT是不可能有错误的，尤其是这位大神实验室经常出一些Nature, Science的，所以说
还是我没有看明白。现在还是直奔主题吧！问题幼稚，还望大神们多多指教！
文章链接在这里：http://www.nature.com/nbt/journal/v27/n3/full/nbt.1526.html
我们是想用它的方法进行细胞转座子分析，看看细胞内的转座子都跑哪里去了。因此我
想follow他们的LM-PCR方法。
原文272页的Pyrosequencing说到：把转座子的左边用BfaI切，右边用NlaIII切，然后
与合成的linker连接：引物的设计如下：
To make the BfaI linker, the following oligonucleotide sequences were
annealed together using standard protocols, top strand 5’-
GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3’ and bott... 阅读全帖 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 39 if to alternative splcing 3'-end multi ployA sites plus that alternative
ORF length are so longer than superscript reverse transcriptase can cover
likes 20kb then only
one choice is use that oligo dt and Multiscibe reverse transcriptase
then PCR different fragment by diffeeernt forward and reverse primer pairs
set then sub-cloning then sequencing then assembly different fragment to
one super long ORF.
Multiscribe |
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g*********5
发帖数: 2533 | 40 rna 蛋白相互作用
想直接从公司 order rna 5‘ 标记的oligo, 50 bp long。 IDT could link Licor
dye to the RNA.So use it I could see the shift directly from gel.
大家order rna的时候，是不是 都要用hplc纯化？
charge another 75刀
脱盐不要钱, but I don't know if the desalt quality is fine for the RNA-shift
experiment.
thanks |
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h******y
发帖数: 351 | 42 用TALEN和ZFN的话off target的可能性也是有的。TALEN单侧靶位点一般设计16-18个碱
基，但是由于任何一个TALEN domain对相邻TALEN domain与靶碱基的结合是有影响的，
所以TALEN是可能结合到imperfect match的位点上去的。
由于TALEN的设计要在蛋白质水平进行，可以想象合成4^16种TALEN蛋白，从而对TALEN与
靶位点之间的特异性结合进行完全充分的研究是不可能的。所以实际上还没有文章像CR
ISPER那样对TALEN靶位点的每个碱基的重要性进行过系统的研究。相反，CRISPER只需要
合成oligo，单个碱基的突变很容易实现，所以能发现前面12-14个碱基最重要。但是这
并不等于说CRISPER只需要12-14个碱基，只是其余碱基的重要性相对较低而已。 |
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N****n
发帖数: 294 | 44 idtdna is what I used and had problem with. |
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a****d
发帖数: 1919 | 45 you may try genescript or genewiz |
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m****M
发帖数: 360 | 47 多长的引物？怎么看出的少了一半？上面设有不配对的突变？如果老是这条有问题，而
另外一个是好的话，肯定是你自己的引物和模板那里不对。我用IDT从来没有什么问题
。 |
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m****M
发帖数: 360 | 48 Can you describe it in detail? If 5' is missed, how did you clone the gene (
T-vector ligation)? If 15nt is missed at 3' how the primer complement with
your DNA plate correctly? If it complemented at right position how did you
know 15nt is missed sine it will be identical to one of your DNA strands?
tried
similar
news |
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N****n
发帖数: 294 | 49 A PCR was performed and cloned directly into vecotr by ligation (primer
phosphorylated first). Sequencing indicated that one primer was missing 15nt
from the 5' end. Because the 3' end of the primer is intact, that is why
the PCR worked fine.
( |
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B******o
发帖数: 496 | 50 他家的kit质量不错，就是有点贵
敏感度不错，主要是通过oligo之间搭桥来放大信号
可以单分子成像，可不代表所有signal都是真的，这类放大信号的kit多多少少会有
nonspecific signal。你的control要做好 |
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