T**********t
发帖数: 1604 | 1 交叉学科的典型尴尬啊，我也算是交叉学科，基本就是摸着石头过河。:) |
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x********u
发帖数: 430 | 3 You can try alternative heating and cooling for breaking down the cell. 3X[
95C/1min and -80C/5min].
Try to use GoTaq Hot Start DNA polymerase.
If you still cannot get the desired band, try growing the cell in liquid
culture, and make genomic DNA by PureLink gDNA kit.
Since your fragment is around 200bp, why not just synthesize the sigle
strand oligoes and reconstitute your molecule by annealing on a PCR machine.
Good luck! |
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s*****g
发帖数: 731 | 4 耳朵飘的最热门的词汇中包括personalized medicine，基本美东几个华人的生物医药
的会最常出现的就是这个了。而相关的重要技术就是测序。
我的组跟计算机系有合作。但可惜我对bioinformatics以及测序完全不熟悉。计算机系
的人也成天叨叨着什么新一代测序，或者一下子整个几万个oligo的chip然后测序（不
懂）。
希望有高人们能科普下测序的今天跟未来。 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 5 我在sigma订的RNA oligo，做出来结果一塌糊涂，跑HPLC一看，好几个峰。在IDT订的同样规格同样序列的样品，HPLC出来就是一个单峰。跟Sigma交涉要求退款，理都不理我。
而且这个已经是replacement了，之前订的一次，是浓度不到标识的一半，纯度马马虎虎，有杂峰但是不多。这次的这个HPLC Chromatogram干脆就是群山起伏了。。。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 6 IDT很不错，送货及时，质量也好
Sigma的Oligo 质量差是公认的，自打我从研究生院开始就知道了。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 7 我们一般就是随便跑个PCR, 要那么大量的OLIGO没有用
Sigma的QC部门似乎有问题，产品质量不稳定 |
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O******e
发帖数: 4845 | 8 DNA oligo我们一直用他们的，没啥问题。
service |
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C***k
发帖数: 1570 | 9 我们实验室在他家订的oligo，怎么都不work,过了几个礼拜他家发信说机器出故障，合
成的序列有误... |
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f**********e
发帖数: 1994 | 10 机器的 margin 太低,利润基本上大多是 reagents 来的。你无法想象
ILMN 的简单 library prep 是多大的竞争优势... 一个不稳定的 workflow
可以轻易毁掉一个几万块的 run, 还赔上几星期的时间。
PacBio RS 目前还没看到有任何人的使用报告。可能都是暗干在心里？ :)
Complete Genomics 的 library prep 会是他们的软肋，还有，他们会有
所有 SOLiD 有的问题, 因为他们也用 oligo ligation.
reagents |
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T**********t
发帖数: 1604 | 11 你不是要pull down跟那个enhancer特异结合的蛋白么？你的oligo越长，结构就越复杂
，最后pull down下来一堆别的东西怎么办？ |
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S*****s
发帖数: 287 | 12 我有点好奇你这个实验设计，为什么要用 GSP 做反转录？和 Oligo dT 相比有什么优
势么？ |
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u*********r
发帖数: 1181 | 13 刚才考古了本版
发现有人说可能是nonspecifec binding（不能被unlabeled oligo竞争掉）。
我有点不理解，如果在没有nuclear extract 里面没有看到这样的条带，加了过后才看
到特定的条带，这个算是nonspecifec binding吗？ 在反应体系中只有这个labelled
的probe只要能binding 然后显色的不就是specific 的吗？ |
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s********n
发帖数: 2939 | 14 Do you know where I could order these 300-400 bp oligos? I only find IDT
could synthesize <=200 bp. |
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W*******a
发帖数: 1769 | 15 You need to understand how Illumina seq works. Two ends of the
library molecule anneal to two oligos on the slide, forming
a bridge, and a PCR is performed in situ to amplify this molecule
into a cluster. The efficiency and consistence of cluster forming
is limited by the size of the insert, you can't have very long
product (>1kb)
classical pair-ends are generated directly from short inserts
usually less than 1kb, so no special library preparation method is
required.
For mate-paired, the t... 阅读全帖 |
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b******n
发帖数: 492 | 16 最近需要设计probe for southern blotting to screen the founders， 有一些问题
想请教一下各位:
1）如果是用gene probe， 一般多长比较好？ 有人说越长越好， 可是大概是多少呢？
2） 如果用oligo probe， 50 bp 差不多吗？ 需要准备至少两个吗？
3） 我现在有好几个 enzyme only cut once in the transgene，但是其中好几个都可
能blocked or impaired by CG methylation, 是不是最好都avoid?
谢谢了！ |
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T**********t
发帖数: 1604 | 17 我在ITC订的oligos一般即使只是desalted的纯度也都很好，我跑HPLC看过。 |
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q*****d
发帖数: 445 | 18 最近要做library, 使用这个实验室的方法进行易错PCR
（http://www.msg.ucsf.edu/agard/Protocols/PCR_Random_Mutagenesis.htm），酶
是NEB的Taq,但是效果一直不是很好，35 cycle PCR的浓度还是很低，30cycle特别的少
，请问
大家有什么方法提高产量吗？还是我的方法不够好，谢谢大家。
PCR Random Mutagenesis
Materials
1. Parental plasmid
2. Oligos surrounding region to be mutagenized
3. Error-prone PCR buffer (10x is 100mM Tris-HCl, pH8.3; 500mM KCl,
70mM MgCl2, 0.1% (w/v) gelatin.)
4. 10mM MnCl2 (stock) (make sure there is no brown coloring to
stock soln; if there is it means... 阅读全帖 |
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c******y
发帖数: 148 | 19 我也出现过这种情况
别人这么给我解释的，
如果你是用PCR产物做的探针,PCR的模板来自基因组的话，可能就会把一些28s 18s 基
因片段非特异扩增下来，然后被标记，而28 18RNA的量很大，所有会有信号
解决办法:
1， 使用来自质粒酶切的片段标探针
2，PCR纯化探针后，稀释1000做模板，换另一对内部引物继续PCR，纯化
3，合成oligo片段 |
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c******y
发帖数: 148 | 20 模板是cDNA，
1，cDNA合成之前是否用Dnase I 消化
2，RNA降解途径或者RNA processing过程中会出现polyA加尾现象，我了解的至少植物
叶绿体的RNA的存在这种现象，刚google下，似乎哺乳动物也存在这种异常的加尾，用
oligodT反转录有可能会产生rRNA的cDNA
3 质粒做模板
miniprep的时候是否有痕量的大肠杆菌的基因组污染？
建议放弃PCR做模板，
酶切质粒，或者合成oligo探针
1，2，3的解释也仅仅是个人猜测了 |
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c******r
发帖数: 3778 | 21 具体的实验背景不是很了解，所以瞎说几句，错了概不负责哦
你说的第一种情况确实比较简单。只要array就可以了。当然也取决于你的A基因是什么
。如果是个transcription factor，可以做oligo array。如果是个kinase也可以做
phosphoprotein array。这完全取决于你的具体情况。数据分析也比较简单，因为因已
经知道了，所有发生的都是果，只需要知道这个果的cascade就可以了。
你说的第二种情况就比较复杂点，但是也不是不可解决的。我不太理解你没有
manipulation那么哪里来的phenotype，不过假定你完全不知道这个manipulation，那
么当你做array或者其他screen的时候，你发现的改变可能是这个phenotype的因，也可
能是这个phenotype的果。但无论如何，通过screen你可以把这个可能基因的list缩小
到几十甚至十几个。这个时候可以再在这个list里面二次screen。这时候由于比较有限
的范围，就可以直接siRNA或者overexpression啥的，看你发现的情况来决定了。
如果你说具体点儿，班上热... 阅读全帖 |
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w*****n
发帖数: 107 | 22 1. a) It is not surprising that a gene has multiple transcription start
sites.
b) You can use the Kozak sequence to PREDICT which ATG is likely to be
used as translational start site.
2). This looks odd.Are you sure the direction of the gene you look at is
correct? Because in the kit, there use random oligo to synthesize cDNA,
followed by gene-specific primer for PCR.
Good luck! |
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s******y
发帖数: 28562 | 23 对，是破坏氢键，使得蛋白完全展开，这样蛋白上的修饰（比方说磷酸化和
乙酰化什么的）才能在跑胶的时候体现出差异来。
这个是一个很旧的技术了，好久没有人用了，所以我们一下子找不到protocol,
前面有个同学贴了一个Toxocon 杂志里面的貌似是可用的。就是我不知道有没有
人跑过。
我想请问你一下的是对于一个以前没有跑过的蛋白，怎么大概的根据它的PI value
和分子量估算它在一个胶里要跑多久？跑的时候怎么检查？
我以前用类似的东西跑oligo 的时候可以用紫外检查看看带跑到哪里了，
不知道跑蛋白的时候能不能也来这手？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 24 如果RT-PCR (oligo-dT做的话) 出了问题的话，那么你用靠近3'-end 和靠近
5'-end 的primer pairs 来作出的PCR 的条带粗细会有比较大的差别。
当然，也可以直接用northen 来证明。 |
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Z******5
发帖数: 435 | 25 制备cDNA方面可以做的改进：
1，最好直接用gene specfic primer做反转录，延长反转录反应的时间；
2，如果不用1，最好用oligo dT；
3，如果非要用随机引物，最好减少引物用量（参考invitrogen SuperScript Ⅲ说明书） |
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Z******5
发帖数: 435 | 26 没试过。不过不太建议这么做，合成100bp以上的引物应该不便宜吧。
要是我的话，就直接在primer上加上酶切位点和保护碱基，做普通的PCR。另一部分直
接合成两条Oligo退火（参考构建shRNA），然后与酶切后的PCR产物，酶切后的载体一
起去做链接，一次就能搞定。 |
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a*******u
发帖数: 2 | 27 请问PCR扩增8kb的一个基因是什么难度？
还是说没有普遍性？因基因而异？
我们实验室想以人或小鼠的cDNA为模板，扩增一个大约8kb的基因，导师觉得一次扩增
这么长的片段不太可能成功。确实，我们试了分段P，结果P 4000bp的其中片段都不成
功。我们用的是LA Taq。
请问对cDNA的反转录过程有什么特别要求吗？我们用了oligo和random引物，takara的
试剂盒。
另外如果买相应克隆的话要4000美元，比较不能接受。
大家遇到这种情况是怎么解决的呢？ |
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z*********8
发帖数: 1203 | 28 刚刚做过点。需要先用invitrogen的small RNA kit提总的小RNA,大概好像是250nt一下
的，然后你可以用biotinylated oligo pull down的方法。yield还可以，可以到几个
ug. |
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Q*****n
发帖数: 4546 | 29 那个biotinylated oligo是针对一个tRNA还是所有tRNA的？另外这个yield是从多少菌液得到的？ |
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z*********8
发帖数: 1203 | 30 oligo是sequence specific，所以纯化出来的是single species tRNA.
我做的菌是mycobacterium，我用了1升。我估计你用ecoli的话1升也应该够了。 |
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Q*****n
发帖数: 4546 | 31 我还有一个疑问，你用biotinylated oligo pull down，是不是要用到高温退火，那然
后tRNA还会回到它天然的结构吗？ |
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a*******u
发帖数: 2 | 32 请问以cDNA为模板扩增8kb的一个基因是什么难度？（该基因分子量接近300kd）
还是说没有普遍性？因基因而异？
我们实验室想以人的细胞系或小鼠组织的cDNA为模板，扩增一个大约8kb的基因，导师
觉得一次扩增这么长的片段不太可能成功。确实，我们试了分段P，结果P 4000bp的其
中片段都不成功。我们用的是LA Taq。
请问对cDNA的反转录过程有什么特别要求吗？我们用了oligo和random引物，takara的
试剂盒。
另外如果买相应克隆的话要4000美元，比较不能接受。
大家遇到这种情况是怎么解决的呢？ |
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B******o
发帖数: 496 | 33 谢谢谢谢。
只是我现在遇到的不是杂带，而是压根没有PCR产物。而gene specific primer则有。
多于3'RACE来说。RT反应的前提是oligo dT能够priming上不是么？为啥会没有条带呢？
3
to
RNAs
same |
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c********b
发帖数: 363 | 34 Well, I can share some more of my experience with you.
1, Check out the anneal temperature. If no band here, but your positive
control showed no problem for RT, then I would suspect that PCR failed in
your RACE. You can try touch-down PCR or use 2-step PCR (68 degree for
annealing and extension.
2, Increase your PCR cycles. If the annealing temperature is not perfect,
increasing cycle numbers will help. I normally used 36-40 cycles for 2-step
PCR, in some difficult cases. Also, I tried many diff... 阅读全帖 |
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f**u
发帖数: 346 | 35 看了半天原来是要坐in vitro，这样就容易很多了。
我记得二十几年前就有人用nuclear extract来泡合成的oligo，
然后用gel shift作为readout来纯化DNA binding protein了。
困难的是in vivo。
enhancer. |
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i*****g
发帖数: 11893 | 36 很有意思，看见这么多人在说这个想法。
这个想法我在2005年1月之前，换实验室时，和PI说了，他听不懂这张PPT意味什么。
后来我又换了实验室，2007年（2008？）某天新老板和我听完某个不相关的seminar，
和我说起这个，他才开口说了2句，我就知道他想说什么，
他的反应是，i have not finished my briefing yet, you really understand my
point? 于是就和他说，of course i know what you want to do,然后讨论了半天，原
来他的朋友有这个想法 etc etc，后来我又做了一些Homework，还是决定放弃。这个很
不好做，估计是个死途。
这个技术最大意义是：能找到locus specific DNA-protein complexes。目前的通行做
法是，已知某个protein, 你用CHIP，证明在某个Locus上面，然后开始making story，
编剧。但其实，那个Locus上面可能有几十种特殊蛋白在调控！！！
2004年底，我的想法来源于推广TAP+MS，我已知 TAP+MS... 阅读全帖 |
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a****l
发帖数: 125 | 37 大家都用什么软件设计primer? 不是网上的Primer 3 一类的软件。偶要pick 自己要的
序列， 然后加tag 和cloning site. 以前用了个软件叫Oligo 4. 很方便， 可以计算
Tm 什么的，但现在没发用在高版本的Mac 机上了。 不知大家都用什么？ |
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x*****e
发帖数: 309 | 38 oligo 7.0貌似用java写的，应该有mac版本吧。 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 39 除了楼上大家说的
100 bp + 30 bp + 30 bp也就160bp嘛
可以合成两个<100bp的oligo然后直接anneal，再加点PCR mix两端补齐啊 |
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a***a
发帖数: 40617 | 40 第一次用这玩意儿，大概40nt，5' cy5 label
不是说cy5是water soluble的吗，我用水和ph8的tris，感觉这玩意儿不怎么溶啊。。。
正常吗？跑胶一片smear，我悲剧了。。。 |
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x*****o
发帖数: 441 | 41 DNA 还是RNA? 买来是deprotected的吗?
要是已经deprotected的了,就是你水加得不够,多加点水应该就溶了. 胶smear有可能
是orverload 或者盐分太多. 如果是overload就用大点的 well, 如果是盐就desalt一
下,或者乙醇沉淀一下或者过个柱子.
。。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 42 这种东西我们一向都是用DMSO来做stock
要用水也行，加TE buffer 后放在暗处/室温放过夜，然后离心去掉不溶部分。
。。 |
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j****x
发帖数: 1704 | 43 这种问题你还借什么人气，要借人气你得去军版/中新版哈
直接合成2条oligo然后退火，和目标载体连接 |
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m*****z
发帖数: 1451 | 44 PAGE纯化的都不靠谱，最好是HPLC纯化的
pnk加磷酸不如直接合成带5'磷酸的oligo
这样基本上万无一失了，就是有点贵。
想省钱的还是合成2条primer故意让它们形成primer之间的dimer
PCR后酶切，跑个10%的non-denatured的PAGE，切胶后碾碎，用TE泡1小时或过夜，乙醇
沉淀，记得加点离子。
HPSF |
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N2
发帖数: 81 | 45 事情怎么弄的这么复杂
方法1: 直接设计在长引物里就好,IDT,100nmol,90bases
方法2: 2 oligos to form a adaptor with sticky ends and used in the ligation
directly without recovery , add 0.2u PNK in the ligation and you don't need
primer Phosphorylation |
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a******p
发帖数: 414 | 46 肿瘤组织和受损失的liver都会分泌microRNA到血液中，这已经有报道了， 其他组织摄
取miRNA的报道我没有看到，一个重要的问题是，这种miRNA是单链还是双链，ambion的
technian说单链的miRNA很难整合到RISC上，还有miRNA的浓度有多高， 能不能高到一
个能够抑制其他细胞的target gene， 个人觉得这个一个新发现，但是没有多少的临床
的意义，因为注射的方式oligo应该比口服更见有效 |
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a******p
发帖数: 414 | 47 肿瘤组织和受损失的liver都会分泌microRNA到血液中，这已经有报道了， 其他组织摄
取miRNA的报道我没有看到，一个重要的问题是，这种miRNA是单链还是双链，ambion的
technian说单链的miRNA很难整合到RISC上，还有miRNA的浓度有多高， 能不能高到一
个能够抑制其他细胞的target gene， 个人觉得这个一个新发现，但是没有多少的临床
的意义，因为注射的方式oligo应该比口服更见有效 |
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C*****h
发帖数: 926 | 48 Antisense oligos are not specific either. |
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c*****g
发帖数: 66 | 50 我没做过这个实验。概念上说，你经过一轮pcr (在primer上加universal adaptor)，
biotin就被稀释了一倍，你多几个循环，就可以克隆了。
then |
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