p*****m
发帖数: 7030 | 1 FLY/WORM搞一个reporter gfp实在是太容易了 比弄个抗体只怕还快 被修饰的蛋白的抗
体到是个问题
intracellular的signaling pathway，有了cell culture+RNAi 确实可以绕过fly/worm
了 但是那些global的还需要fly worm啊 |
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l******n
发帖数: 105 | 2 总结得精彩啊！
现在有了RNAi，是不是直接研究非模式生物更有意义？比如直接研究蛇，猪，马，牛，
羊，熊猫？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 3 这两天很忙，就没有空长篇大论了：）稍微说两个我的体会吧：
对于其他学科我不清楚，但是对于生物学这个东西是这样的，越是目标明确的
研究，越是得不到想要的东西，相反，很多假数据和假文章都是因为一开始的
目标太明确而促使某些人铤而走险的。
其中原因，是因为生物学这个东西很多地方都不是那么的清楚，所谓的“理论”
更多的是经验的堆积而不是真的理论。
在近５０年的历史来看，生物中大部分研究停留在基础研究上，没有进入工业化
和工程化，但是寥寥几个从基础研究进入应用有关的东西，都对生物和医学出现了极大的推动作用。这个包括PCR 技术(conventional PCR and microarray, etc.),荧光蛋白以及RNAi. 需要指出的是这些技术大部分都是在基础研究中中被偶然发现然之后才逐渐发展到应用领域的。这些技术，没有一个是被NIH专门指定研究出来的。其中，荧光蛋白的最初发展者甚至没有得到资助，因为审批的人可能觉得做一个什么奇怪的水母里的什么见鬼的蛋白有什么意思啊？又不能拿去做产业，又不能治病救人，而且和人类蛋白一点关系都没有，不如把钱给一个医生。当然，我们现在倒过来看，就可以笑那些审批的 |
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s******r
发帖数: 2876 | 4 你这几个例子一点都不支持中国现阶段的科研分配模式
这些几乎都不需要大量的funding，只要灵光一现，而且都不是大规模
资助的结果。
那么现在大量给钱找那些千人计划，是不是就能做出同样的发现呢？
我个人很怀疑。
这两天很忙，就没有空长篇大论了：）稍微说两个我的体会吧：
对于其他学科我不清楚，但是对于生物学这个东西是这样的，越是目标明确的
研究，越是得不到想要的东西，相反，很多假数据和假文章都是因为一开始的
目标太明确而促使某些人铤而走险的。
其中原因，是因为生物学这个东西很多地方都不是那么的清楚，所谓的“理论”
更多的是经验的堆积而不是真的理论。
在近５０年的历史来看，生物中大部分研究停留在基础研究上，没有进入工业化
和工程化，但是寥寥几个从基础研究进入应用有关的东西，都对生物和医学出现了极大
的推动作用。这个包括PCR 技术(conventional PCR and microarray, etc.),荧光蛋白
以及RNAi. 需要指出的是这些技术大部分都是在基础研究中中被偶然发现然之后才逐渐
发展到应用领域的。这些技术，没有一个是被NIH专门指定研究出来的。其中，荧光蛋
白的最初 |
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s******r
发帖数: 2876 | 5 另外MD做research，有他们的视角，
临床上的观察直接提出要解决的问题，
这是在实验室工作的researcher做不到的。
这两天很忙，就没有空长篇大论了：）稍微说两个我的体会吧：
对于其他学科我不清楚，但是对于生物学这个东西是这样的，越是目标明确的
研究，越是得不到想要的东西，相反，很多假数据和假文章都是因为一开始的
目标太明确而促使某些人铤而走险的。
其中原因，是因为生物学这个东西很多地方都不是那么的清楚，所谓的“理论”
更多的是经验的堆积而不是真的理论。
在近５０年的历史来看，生物中大部分研究停留在基础研究上，没有进入工业化
和工程化，但是寥寥几个从基础研究进入应用有关的东西，都对生物和医学出现了极大
的推动作用。这个包括PCR 技术(conventional PCR and microarray, etc.),荧光蛋白
以及RNAi. 需要指出的是这些技术大部分都是在基础研究中中被偶然发现然之后才逐渐
发展到应用领域的。这些技术，没有一个是被NIH专门指定研究出来的。其中，荧光蛋
白的最初发展者甚至没有得到资助，因为审批的人可能觉得做一个什么奇怪的水母里的
什么见鬼的蛋 |
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j*b
发帖数: 341 | 6 为什么发明PCR的是缪里厮，而不是研究ＤＮＡ复制的Ｌａｂ。
大的推动作用。这个包括PCR 技术(conventional PCR and microarray, etc.),荧光蛋
白以及RNAi. 需要指出的是这些技术大部分都是在基础研究中中被偶然发现然之后才逐
渐发展到应用领域的。这些技术，没有一个是被NIH专门指定研究出来的。其中，荧光
蛋白的最初发展者甚至没有得到资助，因为审批的人可能觉得做一个什么奇怪的水母里
的什么见鬼的蛋白有什么意思啊？又不能拿去做产业，又不能治病救人，而且和人类蛋
白一点关系都没有，不如把钱给一个医生。当然，我: 们现在倒过来看，就可以笑那些
审批的人鼠目寸光。但是，我们自己又如何？
她加上过多的限制，加上过多的现实目标，是不符合科学本身的发展规律的。对于工程
学，目标明确是应该的，也是必须的。比方说你要建一座桥就得规定这个桥什么时候建
好，建成后能通多少辆的车。但是科学不是这样的。生物科学一个美丽和残酷的特点就
是结果的不确定性。很多很漂亮的假设仔细作下去却是错的，或者本来是要研究某个课
题却不小心作出了有关另外一个课题的结果。如果你硬要逼着生物学家 |
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p*******r
发帖数: 4048 | 7 是应该让做基础的人也学1-2年医学。
大的推动作
用。这个包括PCR 技术(conventional PCR and microarray, etc.),荧光蛋白以及RNAi
.
需要指出的是这些技术大部分都是在基础研究中中被偶然发现然之后才逐渐发展到应用
领域的。这些
技术，没有一个是被NIH专门指定研究出来的。其中，荧光蛋白的最初发展者甚至没有
得到资助，因
为审批的人可能觉得做一个什么奇怪的水母里的什么见鬼的蛋白有什么意思啊？又不能
拿去做产业，
又不能治病救人，而且和人类蛋白一点关系都没有，不如把钱给一个医生。当然，我:
们现在倒过来
看，就可以笑那些审批的人鼠目寸光。但是，我们自己又如何？
她加上过多的
限制，加上过多的现实目标，是不符合科学本身的发展规律的。对于工程学，目标明确
是应该的，也
是必须的。比方说你要建一座桥就得规定这个桥什么时候建好，建成后能通多少辆的车
。但是科学不
是这样的。生物科学一个美丽和残酷的特点就是结果的不确定性。很多很漂亮的假设仔
细作下去却是
错的，或者本来是要研究某个课题却不小心作出了有关另外一个课题的结果。如果你硬
要逼着生物学
家出某某 |
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W*******a
发帖数: 1769 | 8 看来你根本不懂什么是‘工业化’，‘工程化’，美国因为80年代分子克隆技术而
兴起的biotech，包括生物试剂，仪器，以及为生物研究而发展优化的技术，可是构成
了biotech的核心，你每天做实验的钱绝大部分都是花在这个上面了。你狭隘的把应用
理解成什么新的药物，genetech搞胰岛素那种东西，正说明了你这种搞基础的根本就
不知道什么是可以促进经济发展的应用研究，也难怪你不理解别人说的什么样的研究
可以促进经济的发展，对中国这个发展阶段有益处
太明确而促使某些人铤而走险的。
大的推动作用。这个包括PCR 技术(conventional PCR and microarray, etc.),荧光蛋
白以及RNAi. 需要指出的是这些技术大部分都是在基础研究中中被偶然发现然之后才逐
渐发展到应用领域的。这些技术，没有一个是被NIH专门指定研究出来的。其中，荧光
蛋白的最初发展者甚至没有得到资助，因为审批的人可能觉得做一个什么奇怪的水母里
的什么见鬼的蛋白有什么意思啊？又不能拿去做产业，又不能治病救人，而且和人类蛋
白一点关系都没有，不如把钱给一个医生。当然，我: 们现在倒过来看，就 |
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s******y
发帖数: 28562 | 9 分子克隆工业化的过程我当然知道。
我想你可能误会了我的文章，
我的文章里面，直接把分子克隆技术，荧光蛋白和RNAi点名为从基础研究
走入工业化的代表。不知道你是否看漏了这一点？
在分子克隆发展起来之前，谁会想到一个温泉里的什么细菌居然能有这种用途？
你认为他们当然去测那些细菌的基因是为了搞分子克隆么? NO! 根本就是
倒过来的！其实是因为他们发现了那个耐热的酶，然后其他聪明的人才想到
要把这个弄去做分子克隆。并不是NIH搞了一个大项目宣布说我们今年要搞出
分子克隆来！然后大家纷纷献策献力什么的。不是这样子的！
那些后来走进工业化的绝大部分都是由不同的人在不同的无关场合下发现的，
然后因为另外一些有工业化头脑的人才想到把他们拿去工业化的。我讲的主要
就是这个前因后果。就是要强调，历史上这些发现，都不是由于某个什么什么
目标性特别强的大项目而作出来的。而是基础研究无心中的产品 |
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t****p
发帖数: 1504 | 10 我自己本人就很想学学。常跟MD了解情况。
RNAi |
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t****p
发帖数: 1504 | 11 凡是应用导向的“基础研究”在我的眼里都不是基础研究，呵呵。
我心目中的基础研究，它的目的就是了解细胞，机体本身的，它主要是问题驱动的。比
如进化上为什么要产生多细胞生物，两性生殖的优势和在不同物种的不同机理；卵子和
一个精子结合后为什么就不能结合其它精子了；细胞做趋化运动怎么将极小的浓度梯度
放大并转化成快速的方向性运动；体细胞reprogramming的原理是什么等等。以前做的
复制专利翻译，RNAi的通路和原理， apoptosis的原理都应该算作纯的基础研究。
那应该支持的基础研究，在我看来一个是问题必须在科学界很重要，在公众看来很有趣
，一个是要求在当前知识技术条件下是addressable的。
当然有些问题是可以转化成应用的，但是比如进化的问题纯粹就是猜谜式的。 |
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i******k
发帖数: 4625 | 12 can't agree more
大的推动作用。这个包括PCR 技术(conventional PCR and microarray, etc.),荧光蛋
白以及RNAi. 需要指出的是这些技术大部分都是在基础研究中中被偶然发现然之后才逐
渐发展到应用领域的。这些技术，没有一个是被NIH专门指定研究出来的。其中，荧光
蛋白的最初发展者甚至没有得到资助，因为审批的人可能觉得做一个什么奇怪的水母里
的什么见鬼的蛋白有什么意思啊？又不能拿去做产业，又不能治病救人，而且和人类蛋
白一点关系都没有，不如把钱给一个医生。当然，我: 们现在倒过来看，就可以笑那些
审批的人鼠目寸光。但是，我们自己又如何？
她加上过多的限制，加上过多的现实目标，是不符合科学本身的发展规律的。对于工程
学，目标明确是应该的，也是必须的。比方说你要建一座桥就得规定这个桥什么时候建
好，建成后能通多少辆的车。但是科学不是这样的。生物科学一个美丽和残酷的特点就
是结果的不确定性。很多很漂亮的假设仔细作下去却是错的，或者本来是要研究某个课
题却不小心作出了有关另外一个课题的结果。如果你硬要逼着生物学家出某某结果，只
能逼得一些 |
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p*****m
发帖数: 7030 | 13 你今天来来回回的十几个贴 没有一个没有personal attack 没有一个不是充满emotion
al的指责 如果搞实用主义的人都是这个水平我倒真替你们悲哀
说个最简单的例子好了 pfizer雇员差不多10万出头 按turn over rate 20年计 每年要
5000个新入行的雇员才能维持平衡 这5000个人里面专业背景不好估计 我也没查到相关
资料 暂且假设1/4需要有生物学相关背景 可能有超过5%要有PhD/MD学位 这个可能还太
保守了。换句话说 就算你们所说的天上掉下个应用产业的可能性实现了 中国本土出现
一个pfizer这样的药企巨无霸 就需要中国的大学每年培养超过1000个合格的生物学学士
超过250个合格的生物学研究者。以每个大学生物系毕业100学士 25博士计（很多还达
不到这个数字），一个pfizer就需要10所大学的所有当年毕业生。如果考虑到生物毕业
生转行比例大的现实，可能需要>20个大学。
明白什么意思了没？光想着老天眷顾往中国掉几个能生金蛋的产业龙头，没有像样的基
础研究根本就是空中楼阁。像某人说的 RNAi文章出来了 中国有人才能抓住这个机会中
国就 |
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p*****m
发帖数: 7030 | 14 你的意思是等RNAi的文章出来 中国一牛人看到了产业化的希望 然后上书教育部开办生
物系 大招生物专业学生 然后快速培养 立马派上用场？
至于"小型高新pharma" 对不起 恕我孤陋寡闻 这年头还有小型企业自己搞药自己弄cli
nical trial自己做marketing然后成长为巨无霸企业的例子么？
基础研究还有更本质更基础的sunnyday讲的光撒网捞大鱼的目的 还有再进一步的教育国
民 训练科学素养的目的 这个我都还没涉及呢 这里就说给应用工业提供劳动力的问题 |
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b****n
发帖数: 311 | 15 没用的。siRNA不用完全匹配就能抑制mRNA.跟miRNA类似。off-target effect是不能完
全排除
的。保险的方法是做RNAi之后的rescue。 |
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p*****m
发帖数: 7030 | 16 这个就不一定了 具体在体内细胞怎么死了怎么不死肯定是很复杂的事情（否则也很难
理解为什么只死DA neuron 而且位置还特殊）。但是拿到体外培养成iPS，只要能模拟
出个条件让他们比control iPS->neuron死的快死的早，直接上RNAi screen或者small
molecule screen就行了，我觉得根本不需要彻底模拟体内环境 呵呵 我现在崇尚暴力
美学
在 |
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h*****o
发帖数: 342 | 17 可是如果涉及到几个基因相互作用，你刚才说的那种RNAi方法就不容易筛出来了 |
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p*****m
发帖数: 7030 | 18 刘庆华同学在做RNAi啊 别的好像都还是apoptosis
刘雪松同志是不是去了abbott呢。。 |
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p*****m
发帖数: 7030 | 19 不知道
晓东的门徒们这几年我唯一还记得的paper是chunying du的一片Cell 把caspase 2和ce
ll cycle连系起来的 很不错，别的印象都不深了。可惜据说chunying的paper出来的太
晚 结果没过stowers的晋升
当然了 刘同学的RNAi不算在内啊:) |
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n********k
发帖数: 2818 | 20 I think Qinghua Liu is doing well in the RNAi pathway, his study on kinase
is nice...and also shall watch out
Zhong qing at stanford who is dissecting authophagy with a biochemical and
purification approach...
ce |
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p*****m
发帖数: 7030 | 21 这两个assay有问题是肯定的，但是用作purification assay（or assay for RNAi
screen）到底具体技术问题是啥呢？要说晓东当年的apoptotic assay，先用DNA
ladder,后用caspase cleavage，也都未必一定要和apoptosis有关吧 但是能purify出
正确的东西就成呀
在用 |
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a****k
发帖数: 1130 | 22 RNAi screen是没问题的，但是用做purification是不可能的。能用做purification的assay本身必须reliable, rapid还要sensitive，而且从in vivo的现象到in vitro真正可以用来test column fractionation还是有巨大差距的啊
当然，你说的晓东这些例子肯定是没问题的啊，因为最终的目的就是要把一个生物现象简化到一些biochemical reaction嘛 |
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a***e
发帖数: 1010 | 23 Both siRNA and lentiviral shRNA methods are good enough to reach your
goal.
However, lentivirus usually has a higher infection efficacy than
transfection method. Therefore, using lentiviral shRNA may be a more
efficient
way to knockdown gene expression. |
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a******n
发帖数: 392 | 24 多谢。如果用lentiviral shRNA，infection 之后几天可以用puromycin测定
transduction的效率？ 在加puromycin之
前，需要把细胞重新plate吗？ |
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a***e
发帖数: 1010 | 25 No, it does matter.
The contamination of DNA in the RNA sample will mask the fold change
caused by RNAi.
For example, your RNA is 10 before treatment, but 1 after treatment. Thus
the fold change is 10.
However, if you have 5 part of DNA in your sample, the fold change 15/6 =
2.5 fold.
DNAase |
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O******e
发帖数: 4845 | 26 Off-target effects might have contributed to what you got. I would try
several
more siRNA oligos targeting different regions of your gene to confirm the
death phenotype. At the same time, try to rescue with resistant constructs.
siRNA |
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j*********o
发帖数: 237 | 27 谢谢，我的siRNA是在dharmcon买的，实际上是一个pool，一共有4条siRNA，商品化的
siRNA需要测试off-target effect吗？也许可以用小鼠的cDNA去rescue。这个基因在小
鼠和人中高度同源。 |
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n****n
发帖数: 165 | 28 Rescue assay is really important for your phenotype. I guess your gene maybe
have some function in Mitosis. |
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T**********r
发帖数: 287 | 29 针对一个基因，order了3个Thermo GIPZ lentivirus shRNAmir，侵染细胞，通过
puromycin
获得stable cell line，之后通过western blot检测，三组shRNAmir都没有明显降低蛋
白水
平。这种情况是否有必要用realtime PCR在检测一下，希望牛人能推荐一下好用的Q-
PCR kit. |
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a*****g
发帖数: 543 | 30 I guess Q-PCR your target mRNA is worth it. (Although figuring it out does n
ot solve the Kd problem).
It's odd that three clones didn't work. Unless your gene is super essential,
and the mediocre-infected cells survived. What's the death rate after selec
tion?
Rather, I assume you have a non-infected cell line treated with same dose of
puromycin and observed complete cell death?
Some cells are just more tolerating to puromycin than others. |
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T**********r
发帖数: 287 | 31
does n
essential,
selec
dose of
多谢答复，我所用lentivirus vector上都带有tubo GFP,所以puromycin筛选时,我拿到
是100%绿的cell line，对照组相同浓度的puromycin在一天内就可以将没转染的细胞杀
死。
我要knock down的基因是个转录因子，在发育中决定cell fate determination。
一个set中三个克隆都不起作用，很少见吗，以前做knock down比较少. |
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a*****g
发帖数: 543 | 32 then you should definetely check your target mRNA.
If possible, measure the ShRNA products as well.
I suppose your target protein does not have an extream long half life?
WHere did you buy these ShRNA virus? The TRC (Sigma) sells some validated SH
RNA. If they fail, you can request a replacement. |
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T**********r
发帖数: 287 | 33 I bought the bacterial stock from Thermo Scientific Open Biosystems
Expression Arrest GIPZ Lentiviral shRNAmir. How can I check whether the
shRNA is a validated one from the sigma website? Thanks a lot!
validated SH |
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O******e
发帖数: 4845 | 34 1. Make sure your antibody really works;
2. Regular RT-PCR should be tried first to test the knock-down efficiency. |
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S*******m
发帖数: 34 | 35 我买过sigma和open biosystem的 shRNAs。 Sigma 的从来没有失败过， 而open
biosystem有可能不work。 我建议你从简单的步骤开始查起，先酶切看看你得到的克隆
对不对。省时间省力气。如果你拿到的是菌株，多挑几个克隆试试。 |
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s*****g
发帖数: 7857 | 36 你有过用SABiosciences ShRNA的经验吗?谢谢! |
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S*******m
发帖数: 34 | 37 没用过。不好意思，帮不上忙。我倾向于买sigma的。 |
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a*****g
发帖数: 543 | 38 search their website.
MISSION ShRNA. If it's pre-validated, they will state that so it's a selling
point. |
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a*****g
发帖数: 543 | 39 agree with you.
Bought two clones from OpenBiosystem, one of them didn't even contain any fr
agment in the vector (only if the vector was the right one) |
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d*******w
发帖数: 45 | 41 Too expensive. We bought 5 clones from open biosystem (TRC) and two out of
them are working. The total clones only cost $300-400. |
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m*********7
发帖数: 5207 | 42 In theory it should work, but then you have to make sure it is not due to
off-target effect, and later rescue the phenotype by making RNAi resistant
GFP-GOI to demonstrate specificity. What's more, what if the effect of
endogenous and ectopic GOI are not additive or synergistic? |
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n********k
发帖数: 2818 | 43 Yeah, you could well be right... but NO offense, it does smell like a joke
to me...All cancers and diseases...who
need them to tell us the RNAi tech could have the potential to cure...show
me then....guess scientific joke is
not the a invention of Chinese news... |
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b****n
发帖数: 311 | 44 liposome injected in blood will accumulate in liver first, this is just very
very basic physiology. Undergraduate of bio major should know this, nothing
related to drug delivery and formulation的胜利.
The company is clear about this point, and wise to target liver cancer.
RNAi has potential for many diseases, the major obstacle is targeted
delivery. This company didn't make a sound progress yet. Still long way to go. The report is so naive, like a typical Chinese one. |
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f****b
发帖数: 314 | 45 "The openbiosystems lentiviral vector includes a tetracycline inducible
promoter that produces tightly regulatable RNAi."
虽然我没有细看，但显然不是CMV那么简单的事情。你自己的实验，你自己要看清楚。 |
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T**********r
发帖数: 287 | 46
inducible
多谢提醒，不过你提到这个是openbiosystem的另外一个系统TRIPZ，的确是用
tetracyline
induce的。
Open biosystem有两种shRNAmir系统实现knock down:
a.Stable knockdown: GIPZ；shRNAmir is constitutively expressed as a
polycistronicvector that codes for tGFP, puromycin resistance
marker (Puror) and the shRNAmir.
b.Regulated knockdown: pTRIPZ,也是你提到的。
见链接
http://www.openbiosystems.com/collateral/rnai/pi/Lentiviral%20shRNAmir%2
0for%20Stable%20and%20Regulatable%20RNAi.pdf
再次真诚感谢，有了质疑，才能避免将来实验走弯路。 |
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j**********k
发帖数: 296 | 49 According to Web of Science，他关于lipid metabolism的citations大概2.5k（
postdoc期间的SREBP discovery相关），独立做PI后，关于cell death的citations大
概27k，关于RNAi的大概0.55k。合计应该刚好超过30k。刨去非1st或非通讯作者，
完全contributed by him的在25k以上。 |
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m****n
发帖数: 1066 | 50 RNAi,in vitro transfection.
Control and siRNA treated, QPCR data.
Which one to use, equal variance or unequal variance?
Thanks. |
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