s****a
发帖数: 4 | 1 谢谢neverthink!
哦,我可能是要做不是模式种的方向,所以到目前为止还没有可利用的转化和直接去敲出
目的基因,那么对这类病原菌,除了用RNAi来验证其致病因子的功能外,现在好象没有什
么新的技术了,对吗?
即使现在用蛋白组学和EST文库找了很多致病因子[一般都上百种],但要是一个一个验证
,我感觉实验没有什么新意,最多用相同的方法做不同的基因;
我最近看了一些文章,一般如果是做第一个致病因子的功能研究并结合host的话可发
plant cell ,但第二个就掉到plant J,甚至差点MPMI. |
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m*********7
发帖数: 5207 | 2 消极怠工两个多星期了，觉得实验室的生活很无聊。
现在做signal transduction，无非是跑胶，western, IP; 然后用一些inhibitors阻断
，用RNAi knock down，或者over-express dominant negative construct.实验技术和
思想方法很长时间都没什么长进。可是这也怨不了别人，因为也是我前期的结果把我引
到这条路上来的。
听听seminar，看看人家lab做的东西，觉得都比我做的有意思。
怎么办呢？ |
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m*********7
发帖数: 5207 | 3 RNAi技术, GFP的发现, 端粒酶与衰老机制，无疑都是重要的，可是有哪一个比得上in-
vitro fertilization对人类健康和家庭幸福造成的影响更深远呢？到目前为止，已经
有四百万人因为这项技术获得了生命啊。
炸药奖的评奖标准到底是什么？ |
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d****u
发帖数: 1553 | 4 我有一点点转不过弯来。当进行shRNA 的genome wide screen的时候，最后要提取基因
组DNA然后PCR扩增hairpin
sequence为下一步无论是array还是sequencing做准备。这一步PCR怎么能保证扩增出来
的产物还在线性范围内呢，还是
有什么特殊的算法。有没有同学做过，给个提示啊。谢谢了先。 |
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O******e
发帖数: 4845 | 5 你是不是想多了？一般不是提DNA做PCR then sequencing然后知道到底是哪个/些基因
被knock down么？ |
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O******e
发帖数: 4845 | 6 你这是在拼概率。
干嘛不去做个microarray，直接知道哪些基因的表达被下调，比你知道哪些hairpin被
富集直接多了。不过就是比较贵，呵呵
hairpin |
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d****u
发帖数: 1553 | 7 策略大概是这样的，首先假定这是一个negative selection， 筛选marker是细胞的生
长速度。我们用一个pooled shRNA library（好比说有100K hairpins）去转染或感染
细胞。那么经过一段时间的细胞分裂之后（让我们假定一个月），有些hairpin会使细
胞增长加速，有些hairpin会延缓细胞生长。从表象上看就是在整个细胞群体中，有些
hairpin被富集了，有些被降低了。这时候就可以收细胞提DNA，然后PCR扩增hairpin
sequence。然后或者上array或者上nextgen sequencing。两者的read out都是hairpin
在整体中的丰度。然后再normalize to 第一天的data。就能算出哪些hairpin可以促进
或抑制细胞生长了。我的问题就是这时候做PCR如何保证整体里不同的hairpin是线性扩
增使得最后的read out能够进行比较。我的理解是这时候不管是array或sequencing都
不能让你知道在整个population里那个基因被knockdown了。而是告诉你你的这个DNA中
有哪些ha... 阅读全帖 |
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w********r
发帖数: 1431 | 8 我记得Scott W. Lowe有片筛选肝癌里tumor suppressor的cell就是这么干的，
不过没仔细看，不记得他的文章里有没有说这个问题。
但我觉得PCR效率应该影响不大，primer都是一样的，扩增的又都是shRNA的序列，而且
又很短。
现在的ChIP-Seq也都是加了adaptor扩增后去测序，似乎也没有考虑PCR效率的。
hairpin |
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c******r
发帖数: 3778 | 9 明白了
这个是没有办法的事情。PCR扩增确实可能产生系统误差，但是目前没有办法完全消除
这个误差。当然楼上也说了，这么小的hairpin，又是唯一的primer，应该效率是差不
多的，这个系统误差应该不大。
所以这个PCR之后的只是筛选，挑出可能的candidate，然后还需要其他方法进一步确认
。比如你挑了10个candidates，可能只有3个被确认，也可能有9个被确认，这个就看你
下一步怎么弄了。
hairpin |
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p*****y
发帖数: 44 | 10 你担心的是PCR效率问题。但是在做screen的时候，所有样品都是用同样的条件进行，
所以误差可以忽略。线性的问题主要决定于hairpin在不同样品里的浓度，以及你PCR的
循环数。最佳的条件当然是PCR Template在每个样品之间都一致，这样在同一个循环结
束。告诉你一个Trick,我都是先用Real-time PCR定量每个样品的hairpin浓度，然后调
整到每个样品一致。再根据Rreal-time PCR选择最后一个还大致处于线性扩增的循环结
束。因为Microarray, Sequencing都要很多PCR产物，做两轮PCR会更好。 |
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g******1
发帖数: 244 | 11 慢性危害这事，还真得慎之又慎。
10年前如果说吃核酸对动物有危害，那所有生物男都得说这是胡扯。
可是现在知道，直接给一些害虫喂表达了特异性RNAi序列的植物，也可以控制害虫。所
以核酸还是会以
某种形式被直接吸收的，只是具体原理不清楚罢了。 |
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w******e
发帖数: 1187 | 12 Discov Med. 2009 Dec;8(43):253-6.
The road to therapeutic RNA interference (RNAi): Tackling the 800 pound
siRNA
delivery gorilla.
Meade BR, Dowdy SF.
email:q****[email protected]
Thank you! |
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n********k
发帖数: 2818 | 14 Joke of the day or what?
there is not a most shameless but more shameless!
Results: 33
1.
Viable fertile mice generated from fully pluripotent iPS cells derived from
adult somatic cells.
Zhao XY, Li W, Lv Z, Liu L, Tong M, Hai T, Hao J, Wang X, Wang L, Zeng F,
Zhou Q.
Stem Cell Rev. 2010 Sep;6(3):390-7.PMID: 20549390 [PubMed - in process]
Related citations
2.
Production of mice using iPS cells and tetraploid complementation.
Zhao XY, Lv Z, Li W, Zeng F, Zhou Q.
Nat Protoc. 2010;5(5):963-71. Epu... 阅读全帖 |
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o**4
发帖数: 35028 | 15 我也不确定那个比较有效果，所以我想同时加进去，会不会效果更好点?
同一个细胞会不会同时感染三个不同的lentivirus？
谢谢 |
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o**4
发帖数: 35028 | 17 O(∩_∩)O谢谢，
也就是说会有叠加效应是吧？ |
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n********k
发帖数: 2818 | 18 u would have to prove individually first before pool them...or you would
have to design ways to control for the off target effects... |
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v***a
发帖数: 1242 | 19 弱弱地问一下，一般大家都用什么方法来说明有没有off target effects？ |
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w***a
发帖数: 4361 | 21 换几种不同的siRNA against同一个target，
然后看phenotype是否一致？
其实任何siRNA或多或少都有off target effect，特别是siRNA浓度大的时候。 |
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c******r
发帖数: 3778 | 23 不确定就分开三个试试好了，混一起有几个问题：
1. 增加了off target的机会。
2. 发paper的时候，如果是critical experiment还是需要证明单独的siRNA起效。
3. 混一起，如果virus的效率很高也就罢了。如果效率比较差，那么会有很多cell只感
染一个，两个的。你最后的phenotype就会比较moderate，以后的实验就比较麻烦。
这个跟pool的siRNA transfection一样。如果只是一个比如说pilot experiment，其实
倒是无所谓，混着就混着用好了。 |
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o**4
发帖数: 35028 | 24 其实都是同一个基因的设计的3哥不同的lentivirus啊，
如果哪个基因有表型，我再分开分析就可以了吧？ |
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s**********r
发帖数: 1120 | 25 难道不是细胞被一个病毒感染后会“关闭”自己，其他病毒不容易再感染了吗？ |
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r***e
发帖数: 2539 | 26 我以前也听说过这个，但是事实证明细胞能被反复感染的。 |
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v***a
发帖数: 1242 | 27 为啥混在一起会增加off target？我以前听说的是（我只做过siRNA）混在一起反而降
低了off target effect。 |
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a****k
发帖数: 1130 | 28 倒是和他吃过一顿晚餐，不熟，聊天的时候感觉人挺nice的，就是不知道对外人和对自
己实验室的会不会不一样了。而且当时同在的有field的几个大牛老板，所以估计大家
都会表现的很nice吧。。。
Burnham |
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p*****m
发帖数: 7030 | 29 可以的 打个比方吧 如果果蝇也有DRG，那可以在DRG+ neuron里面做这个RNAi screen,
这样你至少知道你找到的基因一定是和DRG的功能有关系的 下面就好做。当然，这样你
就没办法找到新的neuronal population，这个可以用gal4 screen互补。
你说这个思路在老鼠里很多人用阿 allen brain atlas就是这个目的 呵呵 你举的这个
倒是看着不太典型（不是unbiased）。再比如说这个 也算是当年神作。。http://www.sciencemag.org/cgi/content/full/306/5705/2255 |
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F**********6
发帖数: 90 | 30 the major concern of transgenic RNAi (300-400 bp) in Drosophila is off-
target. In addition, Knock-down of some gene may kill the neuron. |
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s******y
发帖数: 28562 | 31 我有一个很傻的问题啊，在我仔细看那个文章之前，我想知道他们是怎么做那么大规模
的RNAi screening 的？莫非他们有一个很大的shRNA library? |
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y******8
发帖数: 1764 | 32 是的。奥地利做了一万多个转基因RNAi lines。四年多前，这个stock center刚成型，我隔壁的一位PI说，如果他是postdoc，就跑到奥地利做上一年，把他想做的phenotype 筛一遍、 |
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y******8
发帖数: 1764 | 33 如果你做果蝇，当然可以要。
不过最好还是合作。RNAi筛东西表型不是很强，所以最好把网撒大一些。 |
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p***a
发帖数: 6202 | 34 果蝇的遗传搞得太清楚了，各种resource非常庞大细密
各种突变型,rnai转基因等等都有，可以通过网上查找，order.
http://flybase.org/ |
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s******s
发帖数: 13035 | 35 果蝇做RNAi screen应该还是很爽的，要啥组织就cross啥
enhancer trap. 就是没有rdrp,效率不太高啊 |
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a*****y
发帖数: 269 | 36 【 以下文字转载自 SanDiego 讨论区 】
发信人: alvinpy (生命就是一场歪打正着), 信区: SanDiego
标 题: Post-Doc Positions at Pfizer
发信站: BBS 未名空间站 (Tue Nov 16 20:10:46 2010, 美东)
Please send in cover letter and CV to Nathan Lee: n**********[email protected]
Postdoctoral Positions in Pfizer Oncology, La Jolla CA
The post doctoral positions will be responsible for elucidating the
mechanism of action of existing Pfizer
portfolio compounds, ensuring that we have the appropriate patient selection
strategies for such
mechanisms, aligning ... 阅读全帖 |
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p********i
发帖数: 116 | 37 第一次用合成得oligo做RNAi，使用lipofectamine 2k转的293，转染的量按照说明书来
的，但是没有效果。看
到很多paper上面都是转多少nM，我是转了100pMol，会不是太少了，还有paper中的nM
这个写法应该是终浓
度吧，到底应该转多少合适呢？看到dharmacon上面推荐终浓度是25nM。谢谢。 |
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w******e
发帖数: 1187 | 39 norvatis撤了alnylam的单。不过据说是为了自己单搞一摊。 |
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w******e
发帖数: 1187 | 40 不过有100M＋的cash in hand哦~ |
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w***a
发帖数: 4361 | 41 RXi那个东西貌似原理没公开，俺们lab有人在细胞系里用过，说是效果跟用liposome t
ransfection差不多，但是不需要transfect reagent。
但是it的siRNA并没有overcome delivery的问题，直接iv injection，还是会降解，我
看也没多大进步。 |
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w******e
发帖数: 1187 | 42 哦～只是在cell里用的话，ms dharmacon也搞了一个。话说有个组一直在做
coadminister
ss PS ON 对其他ON的uptake有帮助，不知是不是类似原理呵呵。
degradation挺头疼。RXi那个东应该是modify过得，忘了是LNA还是啥了。
要是NP能work就好了，即使简单conjugate到surface上，从3D到2D造成的degradation
减缓就会很可观，更何况还可以包埋＋controlled release，要是在加上targeted
delivery（我的最爱啊）就完美啦hahaha~说起来还是mark davis的东东最接近我的
口味啊，不知release mechanism是什么
t |
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a****d
发帖数: 1919 | 43 还有Thomas Tuschl,话说David Bartel的谱系太强大了 |
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w******e
发帖数: 1187 | 44 借人气问：stanford的Kay lab在这个领域地位如何? |
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w******e
发帖数: 1187 | 47 1. why do you think it lacks specificity? just curious
2. a LOT of therapies are based on manipulation of one gene/one protein bah.
..
3 & 4 are true. However, there are multiple administration routes and
multiple
target organs which lead to different area under curve |
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w***a
发帖数: 4361 | 48 1,2,3都不是问题，第四个问题谁解决好了谁再拿一次炸药奖。 |
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w******e
发帖数: 1187 | 49 the whole point of say having a kinase is probably the kinase motif,
isn't it? multi-functional proteins are mostly undruggable bah |
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s*r
发帖数: 2757 | 50 对呀 对呀，很多小分子要都是针对某个pathway来的，
oncogene请展开说说你的2
bah. |
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