i*****i 发帖数: 154 | 1 如题,我指的是cluster,也就是read1/read3算一个 READs。
谢谢 |
j*p 发帖数: 411 | |
M*P 发帖数: 6456 | 3 直接所有RNA都抓出来测序是没希望的,因为表达太低了。
【在 i*****i 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 如题,我指的是cluster,也就是read1/read3算一个 READs。 : 谢谢
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i*****i 发帖数: 154 | 4 我们想做的是LncRNA的差异表达,本来打算用array来做的,比起传统的array,LncRNA
的array还是很贵的。但是我们觉得RNA-Seq能够得到更多的信息,而且作Multiplexing
的话,一个lane可以做4-6个sample。
不过刚入门,或者说还没有入门,没有经验。
我们用Core的service。
他们提供两种flow cell,一种是8个lane的Hi-Seq2000,每条lane能得到180M的reads/
Clusters。如果是pair end的话,当然还是180M的clusters,但是reads就加倍了。另
外一种是HiSeq2500,2-lane的flow cell,rapid mode,大概能出300M的reads/
clusters, PE cluster不变,reads加倍,当然价钱也比较贵,但是turnaround time很
快。
就传统的8个lane的Hi-Seq2000而言,一个sample大概能拿到40-50M的数据(cluster)
,pair end测序的话,大概80M左右(两次测序算两个reads,但是他们来源
于一个cluster)。不知道这样的深度够不够LncRNA的分析。
另外,pair end对于分析的可靠性有没有影响,因为毕竟forwad/reverse 两个reads
都是来源于一个cluster. pair end是不是可以提高检测低表达RNA的灵敏度和可靠性。
谢谢帮忙。 |
M*P 发帖数: 6456 | 5 测的再多也用处不大,除非你能用什么手段去enrich lincRNA. 因为lincRNA表达都很
低,你测的read里面大多数都是coding gene/ribosomal RNA,基本上都浪费掉了. 之
所以有人用array,就是因为这个问题。我们最近刚做过,上千个已知lincRNA里,只有
一二百个表达量超过 1 read per million.
你不如先试试 pcr,看看一些已知的lincRNA在你的 tissue里是否表达,然后跟一些已
知的house keeping mRNA比比表达量,你就知道想用RNAseq直接全把lincRNA测出来是
不可能的 。
LncRNA
Multiplexing
reads/
【在 i*****i 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我们想做的是LncRNA的差异表达,本来打算用array来做的,比起传统的array,LncRNA : 的array还是很贵的。但是我们觉得RNA-Seq能够得到更多的信息,而且作Multiplexing : 的话,一个lane可以做4-6个sample。 : 不过刚入门,或者说还没有入门,没有经验。 : 我们用Core的service。 : 他们提供两种flow cell,一种是8个lane的Hi-Seq2000,每条lane能得到180M的reads/ : Clusters。如果是pair end的话,当然还是180M的clusters,但是reads就加倍了。另 : 外一种是HiSeq2500,2-lane的flow cell,rapid mode,大概能出300M的reads/ : clusters, PE cluster不变,reads加倍,当然价钱也比较贵,但是turnaround time很 : 快。
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i*****i 发帖数: 154 | 6 lncRNA的表达一般都很低,我们做qPCR,很多CT都在30左右。但是,如果信表达量这么
低的话,array是怎么检测的呢?我们平时做普通的芯片,30000多个基因,如果过滤掉
低表达基因的话,也就8000-10000个基因的表达量还可以。 如果所有的lncRNA表达量
都很低的话,是不是意味着杂交信号会非常低,可信度也低? |
M*P 发帖数: 6456 | 7 如果是设计的好的array,那么在选probe的阶段,会选那些probe不去pick up不需要的
信号。
【在 i*****i 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : lncRNA的表达一般都很低,我们做qPCR,很多CT都在30左右。但是,如果信表达量这么 : 低的话,array是怎么检测的呢?我们平时做普通的芯片,30000多个基因,如果过滤掉 : 低表达基因的话,也就8000-10000个基因的表达量还可以。 如果所有的lncRNA表达量 : 都很低的话,是不是意味着杂交信号会非常低,可信度也低?
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j*p 发帖数: 411 | 8 1. 如果只想测量已知lncRNA的表达量差异,80M 101bp 应该够了,如果是human 样品。
2. 如果想发现新的lncRNA,200M 101bp比较合适(这也得看你做的体系是否比较特别
,如果是,那应该会有novel lncRNA)。
3. biological replicates比一个样品测得深来得重要。理由(a)transcriptome
assembly已经不是什么新闻,没有novelty;(b)有replicate才有statistics,forget
about cufflinks p-value with only one replicate;(3)如果细胞是in vivo 或者从
组织来,replicates' variation 会比你想象的大。
4. 如果是用ribo 0,reads打75折。
5. 如果是做strand specific library,不要用那种号称4小时就能做完的kit,我看过
不少于5个不同实验样品,很明显可以看到90%reads在正确的strand上,10%在错误的
strand 上(很难判断是在反链上还是由于反链没有除干净)。
6. RNA的量不要太少,那些号称用50pg的样品,出来有很多是PCR replicates (用
random barcode 有助于判断是否是从一个fragment pcr 出来的).
LncRNA
Multiplexing
reads/
【在 i*****i 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我们想做的是LncRNA的差异表达,本来打算用array来做的,比起传统的array,LncRNA : 的array还是很贵的。但是我们觉得RNA-Seq能够得到更多的信息,而且作Multiplexing : 的话,一个lane可以做4-6个sample。 : 不过刚入门,或者说还没有入门,没有经验。 : 我们用Core的service。 : 他们提供两种flow cell,一种是8个lane的Hi-Seq2000,每条lane能得到180M的reads/ : Clusters。如果是pair end的话,当然还是180M的clusters,但是reads就加倍了。另 : 外一种是HiSeq2500,2-lane的flow cell,rapid mode,大概能出300M的reads/ : clusters, PE cluster不变,reads加倍,当然价钱也比较贵,但是turnaround time很 : 快。
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