v***a
发帖数: 1242 | 1 Hi bearbaby 谢谢回答
stress fiber=f-actin吧？我没有按照比例来缩放，右边low cell density是3个细胞
左右。培养条件一样，只有密度差别。你的意思是指密度也能影响GTPase从而对f-
actin有regulation吗？
part |
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s*******2
发帖数: 598 | 2 最近我在做Western blot试验时，发现我的细胞在用药物CDDP处理48hours 后，Actin
band消失，但是control cells仍然有，原因何在？
Is it means actin is not a good loading control , I need to switch to GAPDH,
Tubulin as a loading control?
Thanks for your suggestions. |
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l****b
发帖数: 400 | 3 GAPDH is a glycolysis enzyme and is regulated by many things. In another
words, it is an awful control. Tubulin is better. HSP90 is also good. both
have good antibodies.
But disappearing actin is interesting. worth looking after, don't you think?
Actin
GAPDH, |
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A******y
发帖数: 2041 | 4 Are they the same loading? If your lysates don't have any protein left, of
course you won't have any actin band. Btw, don't assume every lab do BCA or
Bradford before western...
Actin
GAPDH, |
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T****r
发帖数: 4006 | 5 Cisplatin貌似是很久前用的一种抗癌药。
很多常见的house keeping genes,比如actin, tubulin,Gapdh并不是一成不变的，这些
基因也会被调控，包括transcriptional and posttranscriptional的调控，有些细胞
（比如脂肪细胞）只有很少量的actin and tubulin，还是可以继续活着的。 |
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发帖数: 1 | 6 有个千老告诉我。actin敲除的斑马鱼吃起来嫩,转氨酶高的斑马鱼吃起来鲜。
一次油炸200条,加点老干妈拌饭。 |
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p****l
发帖数: 291 | 7 需要一个rabbit anti mouse b-actin 抗体做westernblot对照
对于哪个公司的更好没有任何idea
我目的蛋白抗体来自BD transduction laboratories
请帮忙推荐一个,谢谢!
此外,有人有用多抗unlabeled antibody做intracellular staining的么?比如检测
phospho-stat5.有经验的给一个protocol
最好了,感激不尽! |
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f*********r
发帖数: 1233 | 8 如果你不规定是rabbit，我会建议santa cruz的mouse anti-beta-actin抗体。
敏感性、特异性都超强无比。条带清晰、信号强、干净、无杂带。买一管能坚持用n年
。 |
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n****y
发帖数: 819 | 9 哪位知道有什么公司卖siRNA/shRNA targeting human beta-actin? 最好是target 5'
3'UTR的。多谢 |
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Z******5
发帖数: 435 | 10 因为目前手头只有actin的抗体，想问问用这个行不行。 |
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A******y
发帖数: 2041 | 12 If you are doing nuclear extract and you can see actin...then your technique
is not perfect yet. |
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b**j
发帖数: 415 | 13 maybe you can, if no actin signal for nuclear fraction, then your extraction
is good |
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s******y
发帖数: 28562 | 14 actin 和microtube 没有直接联系，而必须通过一些其他蛋白的介导。
而microtube 在大部分情况下并不在核内形成，除非某些特定的细胞，特定的场合。
你可能是误会把细胞分裂时候的染色体和microtube 的关系吧？
其实细胞分裂的时候核膜一般就解散了，或者通透了，所以和平常时候的核不是一回事。
t |
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b******s
发帖数: 1089 | 15 为什么核膜重新形成时不可以占有部分MT和actin pool呢？
事。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 16 不清楚，可能会被选择性的踢出去吧。
有些细胞核在某些情况下也可以有tubulin的，但是功能未明。
至于核内的actin，大部分研究认为和染色体结构以及transcription 有功能性
的关系。但是机理未明。 |
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m******5
发帖数: 1383 | 17 Nuclear Functions of Actin
Neus Visa, and Piergiorgio Percipalle |
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g*********5
发帖数: 2533 | 18 反正我用kit fraction cell，核里总是有actin，还不少。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 19 这个有非常明确的方案的吧。
一般就是用高盐度（1M tris) 来deplymerize F-actin, 然后用DnaseI resin
来收集单体，然后保存在含钙离子的溶液里。 |
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d****u
发帖数: 275 | 21 2个都用，actin看你equal loading；
磷酸化的定量还得有总的蛋白量 |
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s******y
发帖数: 28562 | 22 You mean you cannot detect beta-actin by WB on your membrane? |
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s******y
发帖数: 28562 | 23 什么样品？用什么胶跑的？转到了什么膜上面？
你有没有用Ponceau S 染染看蛋白是否转过去了？
如果你的样品里有actin 的话，即使转膜不完全，不可能一点都看不到的，
如果什么都看不见，那就有几个可能：
1。 你的二抗坏掉了，或者你的WB reagnet 有问题。 这个是最有可能的。
2。你跑的样品根本就不是普通的真核细胞的样品。 |
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E*****1
发帖数: 610 | 24 But why I can get others except actin |
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s******y
发帖数: 28562 | 25 你是说其他带都能显出来，就是actin 看不见？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 26 如果其他带都能看见（你说的那些什么size marker 那个可不算数），
而且用ponceau S染色后有都能看见蛋白的带的话，看不见actin 那真是见鬼了 |
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E*****1
发帖数: 610 | 27 I did the experiment a month ago, good.
I used the sample to re-run, actin cannot appear |
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s******y
发帖数: 28562 | 28 太奇怪了，你有同时做其他抗体的对照么来确定二抗肯定没有问题么？
必须用同一次配出来的二抗，一半来做actin, 另外一半来做对照抗体。 |
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b**********s
发帖数: 460 | 29 查查看你用的抗体的说明书。有可能你用的beta-actin只识别单一种属，譬如人。 |
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E*****1
发帖数: 610 | 30 I think something with membrane?
I bought pre-made membrane all the moluclar weight around 43-20 KD is
nothing, But I can get tubulin
Another question, except actin and GAPDH
what else I can use for control? |
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a******1
发帖数: 116 | 31 actin的抗体识别C端11个AA，这样也会么 |
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w***a
发帖数: 1053 | 32 我觉得可以检测的到
如果抗体识别位点离gfp不是很近的话
你可以western的时候曝光时间长一些,看看能不能看到gfp-actin条带 |
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w***a
发帖数: 1053 | 33 比值是相对的
内源性actin是很多的
搞不懂你一种条件下看比值什么用 |
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a******1
发帖数: 116 | 34 anti-GFP,anti-actin的背景都还可以的；我知道长曝光这样就算得出个比值也没有意
义，所以要另想他法呀
多谢~ |
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s******r
发帖数: 2876 | 35 不能用其他tag吗？
或者用GFP-Actin + other tag的construct. |
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s******y
发帖数: 28562 | 36 这个很正常，不用担心，
左边的细胞太密了，大部分细胞都被顶起来了，所以成像质量很糟糕。
另外，actin 在组织细胞里面看起来就是和你左边的那个图差不多的，
右边那个里面大部分都是所谓的stress fiber, 是fibroblast这类的贴壁细胞
在培养情况下充分展开后的特定条件下的表型，反而不是正常的组织细胞应该
有的样子。
Bearbaby 说的是对的。 但是你可能是开始接触细胞的人，她说的对于你而言
可能有点太深 ：） |
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s******y
发帖数: 28562 | 37 Stress fiber 是 F-actin的一种形态。
细胞密度影响GFTPase (Rac, Rho, etc. etc.) 是一个已知的现象，也是一个
很多人在研究的领域。 |
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v***a
发帖数: 1242 | 38 谢谢！能不能请大拿再扫扫盲，除了stress fiber，f-actin还有哪些形态啊？ |
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s****R
发帖数: 26 | 39 搭车问一下，有没有好用的gamma１ actin（ATCG１）的anitbody？多谢 |
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s******y
发帖数: 28562 | 40 如果你不在乎是否能分别alpha, beta, gamma的话，有很多很好的抗体，
但是你一定要特别辨认gamma actin 的话，市场上没有卖的，只能找人要 |
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v***a
发帖数: 1242 | 41 我想sunny不会要我这个actin基础知识这么不够他格的人吧…… |
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c********e
发帖数: 598 | 42
这基础知识不是一教就会的,没啥担心的.
担心的是"have no interest in actin". |
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s******y
发帖数: 28562 | 43 Summerwinds说的有道理，但是鉴于那个band size 变小，我再补充一个可能性，
就是actin oxidized。这种情况下是可能会跑得更快的（因为构型变了）
information |
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a******1
发帖数: 116 | 45 in vivo 的actin s-glutathionylation 不是早被证实了的么，以前也用cell lysate
做过了
information |
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j******1
发帖数: 1315 | 47 哪个公司的Actin Antibody? Catalog Number? |
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w******a
发帖数: 65 | 48 是全细胞裂解液（whole cell lysates）还是Triton extracts 或者RIPA extracts？
我的个人经验，如果是Triton sample （通常用于co-IP），有一种可能性是抽提不完
全，药物刺激F-actin增加导致这一部分的骨架蛋白不溶于Triton lysis buffer。但如
果是WCL或者RIPA sample就要考虑其他的原因。 |
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s*******2
发帖数: 598 | 49 Same loading, and CDDP treated cells found clear cleaved Caspapse3 band.But
no actin band.
of
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