b**********8
发帖数: 349 | 1 我们的b-actin，放在milk中reuse，存于-20度，一年都没有问题 |
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h*******o
发帖数: 4884 | 2 sodium Azide at low concentration mainly interferes with the peroxide
reaction (HRP conjugated 2nd antibody). It should be fine to use at a very
low concentration.
After all, it is all up to the antibody. For b-actin, sure freeze and thaw
is fine.
For some delicate antibodies, it will be a big problem.
So for me, unless it is extremely hard to get the antibody, I woudn't reuse
for more than 5 times, usually 3 times. |
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B******w
发帖数: 1040 | 3 一直加0.02%叠氮钠后放-20度，有些抗体能用一两年都没有问题
我们实验室的actin都用了2,3年了还挺好的，反复冻融了不知道多少次 |
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d*******s
发帖数: 61 | 4 我觉得maxi提出来的质粒有时候转染效率很低，可是ratio 260/280在正常范围内。或
许是什么没检测出的东西污染。 所以现在一直用mini提出来的质粒做转染，结果不同
质粒的表达水平——那叫一个均一啊！ 就像actin 一样的 |
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S******9
发帖数: 2837 | 5 是beta-actin的Cre？ 1084，1085，42，43 primers， Wt=300bp， Cre=100bp
才12只pups说明不了问题。
尤其是第一次生，总是litter size很小，后面就好一些。
你这个是inducible还是non-inducible的Cre? |
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b*******0
发帖数: 48 | 6 对的，是beta-actin promoter driven. 大概每次生4-6只，black 6 strain. |
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g***s
发帖数: 30 | 7 我们的方法是：裂解buffer：RIPA ，裂解方法：磁珠快速震荡，破碎larva。然后离心
，加入SDS loading buffer.
结果western结果很奇怪，经常出现一部分样品western没有任何信号，另外一部分完全
正常的情况。跟抗体肯定没关系，因为我们用一些非常好用的如tubulin actin都试过
了。
各位有遇到过类似的问题吗？ 能给支支招吗 |
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c********b
发帖数: 363 | 8 actin是我的一个control所以没有花太多时间去研究。
我也是很痛苦提蛋白才摸索出这个方法的。我主要研究的蛋白是很经典的一个蛋白，表
达很难。我用的植物的基因因为codon bias就更难了。
我知道这个法子可能可以发个小methods，身边朋友试过也都告诉过我，无奈现在老板
没有兴趣，自己独立遥遥无期，加上实验室以前就没有做过蛋白生化，我也只是半路出
家的半吊子，这样投比较麻烦。再说一篇technical的小文章不会有太大用，自己也不想
花太多精力所以昨天犹豫了一下也就把方法贴出来了，能对研究有用才是最终目的。：）
最后说一下，蛋白还是很复杂，所以大家可以尝试一下。大多数情况应该是OK的，但是
肯定有不适用的，那就只能再摸索了。 |
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m******5
发帖数: 1383 | 9 就是说一部分人不相信，一部分人不光相信而且把功能做得很细了。。。。。 |
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c********r
发帖数: 189 | 10 是可以进核的，而且好像进核的还不少，我们实验室有人做过cell fractionation，确
实都有，但是我不知道有啥功能 |
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c******g
发帖数: 49 | 11 请问楼上XD， 你们cell fractionation怎么做的？能否分享你的protocol？谢谢 |
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m******5
发帖数: 1383 | 12 这个很有意思，其实在核解聚的时候很多本来应该是cytoplasmic分布的蛋白都会在核
里检到
但核膜重新形成后又该干嘛干嘛了 |
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n****n
发帖数: 434 | 14 some proteins (residing in the cytoplasm in non-mitotic cells) can be
wrapped into the nucleus at/after mitotic exit. |
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m******5
发帖数: 1383 | 15 I don't think this is always the case:
at least they should manifest some important function to be stabilized
inside cell nuclear.
A lot of other proteins can be wrapped into the nucleus but soon been
degraded |
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s******y
发帖数: 28562 | 16 这个，我必须说，这个文章其实并没有解决他们所提出来的这个问题（你把这个文章看
完就知道了）
Pax6 的确在octopus 里面就是不表达的，但是原文作者因为是基因进化派的人
（而不是比较形态学那一派的人），所以他在行文里面对此抱怀疑态度。但是，
从他们文章里的比较结果来看，那些真正保守的都是一些什么beta-catenin
之类的万金油基因，那个号称和眼睛最相关的pax6反而没有找到。
他们的文章里最后提出的说法是pax6 的一个下游基因貌似在octopus 里能够自行调控
（所以不需要pax6也能搞个眼睛出来）。所以这个文章，其实对他们一开始提出的问题
，并没有做一个很好的回答。
在这里必须再指出一次：
pax6 作为一个非常古老的基因，能够被大多数生物用来在建构眼睛的时候发挥作用，
这个并不奇怪。很多古老的基因(such as actin, cadherin, catenin...)，也是什么
都插上一脚的。
但是pax6 对于章鱼眼睛结构的关系是既不充分，也不必要。很多低等的动物虽然表达
pax6, 但是眼睛结构和人或者章鱼差得天那么远，有的甚至根本就没有严格意义上的眼
睛。所... 阅读全帖 |
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A******d
发帖数: 571 | 17 艳阳天gg涉猎太广泛了。没有什么你不做的。即使不做也都知道，譬如进化论啊人类论
而我对actin的唯一了解就是这玩意儿在WB中太亮了，太亮了，直接拿肉眼都可以看见带 |
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p*********r
发帖数: 99 | 18 版上有人做 ribonucleoprotein immunoprecipitaion (RIP)成功的吗？ 我用Hela细胞
系, Rabbit IgG 和 Protein-G 磁珠 试了几次IP都有非特异的RNA随洗下来。例如
Actin. 求教高人指点成功要点. 谢谢! |
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s********d
发帖数: 156 | 19 跟着也问个问题。
正常和肥胖老鼠脂肪组织做WESTERN，大家用什么做LOADING CONTROL? 貌似actin
Tubulin 都不行，上样蛋白量一样出来的条带差好多。 |
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b******y
发帖数: 627 | 20 If you only need a little, I remember there is a company that sells it. |
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k******0
发帖数: 1073 | 22 多谢了！非常有帮助。有没有参考文献或具体步骤？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 24 这个马甲跟六脉神剑似的，时work 时不 work, 有时候看到的是个裸女，弄的我上班
的时候打开页面都要非常小心，免得被同事们看到了误会 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 25 if is nude guy
sunnyday (飞鱼) 被同事们看到了more 误会... |
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b******s
发帖数: 1089 | 26 在一个生物工作者眼里，难道裸女跟裸耗子，裸果蝇，裸线虫有什么区别吗？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 27 差别大去了！前者是直立行走的高等哺乳动物，后面几个除了老鼠，都低等的一pi |
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l**********1
发帖数: 5204 | 28 En, boulders (walnut) may be another 弗洛伊德 in 21 century.
htp://zh.wikipedia.org/wiki/西格蒙德·弗洛伊德 |
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s******y
发帖数: 28562 | 29 首先，把大牛这个词眼删了吧。我看了标题后半天不知道我该不该回帖。
然后，你这个问题，得通过各种手段一一排除。
１。先用RNAi control knockdown, 来证实不是knockdown 的副作用。
２。用其他方法来抑制myosin, 看看是否有类似效果。
上面两者都证实之后，再用比较简单的方法一一来检查你说的那几种可能性。
１。用其他蛋白来影响golgi stack
２。knockdown ZBP
3. slightly disturb actin by over-expressing capping proteins. |
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s******y
发帖数: 28562 | 30 首先，把大牛这个词眼删了吧。我看了标题后半天不知道我该不该回帖。
然后，你这个问题，得通过各种手段一一排除。
１。先用RNAi control knockdown, 来证实不是knockdown 的副作用。
２。用其他方法来抑制myosin, 看看是否有类似效果。
上面两者都证实之后，再用比较简单的方法一一来检查你说的那几种可能性。
１。用其他蛋白来影响golgi stack
２。knockdown ZBP
3. slightly disturb actin by over-expressing capping proteins. |
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r***n
发帖数: 52 | 31 做IP的negative control一般用isotype control,就是和IP的antibody一样的species,
right?现在我做的IP用的是cell signaling rabbit antibody (polyclonal),
negative control用的是santa cruz的 normal rabbit IgG, 这个有很多的reference
paper引用,看文章上都很干净。但是，我做的结果就是IgG control总有protein of
interest,量和IP的一样多， 这个蛋白是用mouse Ab检测的，MW是90，所以不可能是重
链。奇怪的是，当我检测IP的那个protein (cell signaling),根据说明要4度过夜，结
果发现上次检测的IgG control的目的蛋白量减少了，但不是完全没有，因为我这两个
蛋白都是用ECL检测的，就是说上次检测蛋白的信号还在。但是我又用anti-mouse的二
抗做ECL，IgG control和IP的量又是一样。
这是怎么回事？
还有，有谁知道 cell signaling的Ab用多少... 阅读全帖 |
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r***n
发帖数: 52 | 32 really?如果正好有我要IP的蛋白抗体在里面就会在control IgG里出现background, 但
是这种mixed的，它的量应该小很多。我的是刚开始ctrl和target一样多。（5 min X 3
wash）
sigma 的normal IgG 是干粉，是吗？PBS溶？还有关键是不知道cell signaling的Ab是
神马浓度，它只是建议1:50做IP。我假设它是1ug/ul,但是同样量的santa cruz normal
rabbit IgG 重链量是它的10倍左右。
现在我用cell signaling的actin rabbit IgG做isotype control, 不过这个是
monoclonal的，IP的那个是poly的。过两天出结果。 |
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r***n
发帖数: 52 | 33 做IP的negative control一般用isotype control,就是和IP的antibody一样的species,
right?现在我做的IP用的是cell signaling rabbit antibody (polyclonal),
negative control用的是santa cruz的 normal rabbit IgG, 这个有很多的reference
paper引用,看文章上都很干净。但是，我做的结果就是IgG control总有protein of
interest,量和IP的一样多， 这个蛋白是用mouse Ab检测的，MW是90，所以不可能是重
链。奇怪的是，当我检测IP的那个protein (cell signaling),根据说明要4度过夜，结
果发现上次检测的IgG control的目的蛋白量减少了，但不是完全没有，因为我这两个
蛋白都是用ECL检测的，就是说上次检测蛋白的信号还在。但是我又用anti-mouse的二
抗做ECL，IgG control和IP的量又是一样。
这是怎么回事？
还有，有谁知道 cell signaling的Ab用多少... 阅读全帖 |
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r***n
发帖数: 52 | 34 really?如果正好有我要IP的蛋白抗体在里面就会在control IgG里出现background, 但
是这种mixed的，它的量应该小很多。我的是刚开始ctrl和target一样多。（5 min X 3
wash）
sigma 的normal IgG 是干粉，是吗？PBS溶？还有关键是不知道cell signaling的Ab是
神马浓度，它只是建议1:50做IP。我假设它是1ug/ul,但是同样量的santa cruz normal
rabbit IgG 重链量是它的10倍左右。
现在我用cell signaling的actin rabbit IgG做isotype control, 不过这个是
monoclonal的，IP的那个是poly的。过两天出结果。 |
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F******y
发帖数: 1988 | 35 Clin Physiol Funct Imaging. 2002 Sep;22(5):312-9.
Decreased actin solubility observed during ATP-depletion is mimicked by
severing agents but not depolymerizing agents in isolated and cultured
proximal tubular cells.
To : f*************[email protected]
5黄包子，呵呵 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 36 GTP→GDP already
please go to new book
"New Insights into the Mechanisms
of Cytomotive Actin and Tubulin
Filaments" 2011 Elsevier Inc.
by Christopher H.S. Aylett, Jan Lo¨we, and Linda A. Amos
full text link:
//www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/groups/JYL/PDF/AmosReview2011.pdf
its pp20
On phosphate release, Wang and Nogales proposed that the contact
between T7 and the nucleotide of the adjacent subunit within the E-site
interface becomes disrupted, leaving contacts only on the side of the
subunit–subunit ... 阅读全帖 |
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A*******e
发帖数: 284 | 37 这个BT转基因的promoter十有八九是组成性的，也就是十有八九是35S，再不然是actin
的promoter。这个35S promoter是孟山都专利吗？ 现在最常用的marker gene是hyg或
bar， 这两个是孟山都得专利吗？ backbone里拿常见的pcambia系列来说吧， 我估计
这个有专利， 但是不确定是孟山都的。 如你说的即使这些都有商业专利，自己重头构
建就是费点力。而且现在的转基因的载体多的去了。 郎要真的从技术层面质询别人，
真的取己短来攻别人了。 我知道孟山都手上可能克隆了很多很好的基因，人家不发文
章直接应用，所以外人不知道。但是话也回来了，做植物遗传的人都在勤奋寻找这些有
应用价值的基因，这样既能发好文章， 还能提供潜在的应用。而且也有一些成功克隆
的例子。 |
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s*******e
发帖数: 1544 | 38 郎肯定是咨询了转基因专家，这年头学生物的多了
郎(他的团队)讲的是现在中国搞的那几种转基因水稻用的是孟山都的专利。
至于能不能突破孟山都的专利封锁，张启发等人闭口不提，为什么他们不敢出来晒一晒
他们搞的东西。现在海内外学生物那么多，大家可以好好辩论一下
心里没鬼，躲啥呢？ 急啥呢？
转基因水稻一不能保证增产，二没有长期安全数据，三处处是专利陷阱，这些没有好好
公开论证就要推广太疯狂了。
actin
， |
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w**********0
发帖数: 46 | 39 请问WB检测某蛋白磷酸化，能用house keeping gene做内参照么？
还是必须用该蛋白总的量：磷酸化＋未磷酸化做参照啊。
谢谢了， |
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w**********0
发帖数: 46 | 40 但是很少看到发表的文献把两个蛋白做参照的，如果想发表，放哪一个参照更有意义呢?
谢谢! |
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i*********0
发帖数: 915 | 41 如果这个蛋白,在处理以后,是被induced overexpression, 而且也被磷酸化,这个蛋白
水平做参照有大意义么. |
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k****o
发帖数: 589 | 42 那要看你的磷酸化是什么时间点出现了。几十分钟个把小时，用total就够了。如果半
天，一天什么的，就得加上housekeeping的蛋白 |
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s******y
发帖数: 28562 | 43 我的直觉就是你们可能没有在qPCR的时候做loading control
qPCR 的时候会因为样品制备和实验室试剂的差异而出现比较大的偏差，
所以一般需要一个内部control 来调整最后的值。对于你们这个实验，
是否可以考虑用host cell actin and GAPDH 来做loading control? |
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s******y
发帖数: 28562 | 44 这个需要兼听则明的精神。
多看看不同实验室里出的文章。
另外，对于领域里面的文章，抱着半信半疑的精神就好了。
对于你自己做的东西，尽量做到对得起良心就好了。其他人的东西实在是管不着。
癌症是一个比较特殊的领域，做的人太多，资金压力太大，加上系统又太复杂，
重复不出来的情况比较多。其他领域就好一些。比较说我们做细胞骨架的，
大部分实验结果还是能够重复出来的，只不过某些结论不一定象文章里面说的那么肯定
而已。
因为很多实验条件有偏差。
比方说那个myosin 在actin filament上面行走的时候到底是hand-over-hand 还是
inchworm，用不同方法会得到不同结论，这个倒不是哪个实验室在故意骗人，而是
他们用的方法都各有各的缺陷。 |
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s**e
发帖数: 97 | 45 作为一个在美国念了博士，作了三年博后的人，我想说说我所知道的dirty的 science
。作为我告别这个行业的纪念吧。目前正在转行中，希望自己能顺利离开这个领域。
这个行业带给我快乐，但更多是心灵上的负担。很多时候喘不过气来，觉得自己在这里
面是一秒也呆不住了。
我做博后的实验室在一个二流大学医学院。 老板是典型犹太老头，功成名就，担任很
多行政职务，无数医药公司的顾问。凭良心说老头算一个好人，做事还算要面子，那种
为了自己目的致人于死地，尤其是对比自己地位低的学生，博后 之类不给毕业，或者
不给身份，或者克扣工资之类的事他是没有。来他这儿第一年我要求办绿卡，他同意了
。不光同意，为了paperwork而写那些文件，推荐信，他都改都不改，看都不看的就签
字了。 第二年我要涨工资，至少match NIH的标准吧，老头也答应了。所以老头还算一
个不错的人。但问题是，老头为了数据暗示下面的人。
怎么说呢，你说他公开造假，那纯粹是中伤。老头最爱说的一句话就是: well, it is
what it is. 可他真的这么认为吗？一个假设出来，一个感兴趣的课题出来，一个具体
的实验开始做，老头... 阅读全帖 |
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s**e
发帖数: 97 | 46 但这个西班牙博后居然在treat老鼠的时候对我说，我用xxx药物1uM！！！！各位兄弟
姐妹，老鼠可以treat 1uM??? 他曾经和我讨论一个试验的时候，抱怨xxx公司的一个新
产品没有老产品好用，然后我就说，怎么个不好用法？他说说不清。然后我就说你show
给我看看。他领我到显微镜下给我看他的细胞。各位兄弟姐妹，大哥大姐，当我到显
微镜下一看，他连聚焦都没有聚焦好，看到的都是器皿本身的那些脏物！！根本还不是
细胞层！！！！
这位西班牙博后是老板的骄傲。他的工作老板出去汇报啥的都挑他的。因为那动物模型
的效果是杠杠的！=）我们实验室切片都是送出去给人做的，那图片也是非常漂亮的，
效果是明显的！无论别人怎样，我对组织切片的实验数据是不信的，挑一个阳性，挑一
个阴性是太容易了！老板的新的ro1的申请全是base on他的数据。。。
另外一个博后来在东欧某小国。博后乙一样“优秀”。来一年半，一篇文章已经送出去
，第二篇正在写。博后乙曾经对他的学生说，western loading 2ug 作一个蛋白。然后
出来的beta actin如炮弹一般大一般粗。我很佩服2ug的总蛋白能出这么好的结... 阅读全帖 |
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g*********5
发帖数: 2533 | 47 要么，先试试beta actin? 如果这个不出来，染料有问题？
不过你的产物跑过胶。条带浓亮吗？ |
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i******w
发帖数: 407 | 48 请问大家做E. coli蛋白的WB时，比如比较某个蛋白的表达随药物浓度的变化，都用什
么做内参的啊？
看到做mammalian cell的都用actin，没找到E.coli里该用哪个蛋白，麻烦做过的xdjm
告知一下，先谢过了。 |
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m***o
发帖数: 272 | 49 十分感谢！文章有些难，需要数学背景，打算再用文章里的UBC和rps18检测。如果都和
actin有类似的降低，说明那个样品就是低。用18SRNA总是觉得量太高，无法真正
normalization。而且18s是rRNA。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 50
一直都是做低等真菌和细菌，没有做过人类细胞。但现在课题需要做一些人基因检测和
蛋白在不同cell line里表达的实验。
具体课题是这样的，有一个感兴趣的人类基因，现在想了解一下它在不同细胞系可能的
表达情况。有一些问题，
1. 现在人类基因组有多少不同的版本？有不同人种的基因组吗？比如黄种人，白人和
黑人？
2. 由于实验室没有细胞培养的条件，想直接购买一些样品，比如tissues，cells，
cell lysates和total RNA，哪个公司比较好？我看到ScienCell，IMGENEX和Asterand
有，但是不知道哪个比较好？有没有同修用过？
都差不多。谁便宜买谁的
3. 有没有比较好做多抗公司可以推荐？
4. 如果做western的话，选择哪些proteins做controls比较好？
actin, tubulin
5. 如果想验证transcription，用Northern，microarry还是realtime PCR好？
少量基因用northen or realtime PCR,
大量基因用microarray
新人虚心求教，望各位大牛不吝赐教！
万分感谢... 阅读全帖 |
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