j*******l 发帖数: 1066 | 1 "primer plus" is an introductory book
"primer" talks deeper than "primer plus"
if you know a lot about C, go for a "primer" |
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f********r 发帖数: 904 | 2 通常是1加仑能覆盖400平尺的面积,道理是无论刷什么漆都要先上primer(ceiling除
外),要是新的颜色是深色的,你的primer还要调成过渡色,比如红色要调成粉色的
primer,primer的作用就是把原来的色调封住不再渗透出来,正如楼上说的,刷得越薄
又能盖住原来的颜色效果最好, |
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e********t 发帖数: 9607 | 3 我现在刷墙一定要刷Primer,好处是遮盖能力强,在Primer上刷漆比在干净墙上省漆。
我觉得Primer+一层漆比不刷Primer刷两层漆效果好省力又省钱。
prime |
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e********t 发帖数: 9607 | 4 说一下我刷墙的顺序,每个人可能做法不一样,仅供参考。
刷子:puddy的2寸斜角刷子一把。
刷子梳子:puddy的不锈钢梳子一个,洗刷子用的。
滚筒:puddy的滚筒,给primer一个,然后给每种颜色的漆一个。
滚筒架子:一共三个,其中给primer一个,给深色漆一个,给浅色漆一个。
滚筒盘子:金属的盘子一个,垫在金属盘子中的塑料层,给primer和每种漆一个。个人
经验:带凸点的那种比那种带横条纹的好用的多。
先用TSP溶液洗一遍墙,把能去的污渍尽量去掉。
用drywall compound或者专门补墙的东西补墙上的坑,用putty knife抹上,可以补得
比周围高一些。干后,用paper towel或者布沾水把边缘模糊,高出的地方磨平。标准
的方式是用砂纸打磨,但我现在不怎么用这种,因为会有灰尘。
刷primer。
刷漆(1-3遍,视效果而定)。
每次刷完后洗刷子,用梳子把刷子刮干净,再加点洗手液洗掉,晾干。看起来麻烦,实
际上就是1-2分钟的事。
滚筒洗起来很麻烦,而且洗过之后的滚筒状况会变差。但是puddy的滚筒虽然好用,一
个$3多也不便宜。我一般就是拿个塑料袋包起来,尽... 阅读全帖 |
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d*******r 发帖数: 1831 | 5 分享一些经验:
1.刷之前一定要清洗干净,绝不能有油污或清漆。
2.上primer之前要sand,如果有小坑用caulk补平。如果你要刷浅色,则要primer好几
遍,但每次要刷的薄些,干了以后sand,两次primer之间不要超过24小时。
3.用好的涂料。一个方向均匀用力的刷。如果橱柜表面不是平的,先刷凹槽和边角,注
意涂料不要蘸的太饱,以防干了以后有些大滴凝聚在凹槽和边角。一般刷两遍可以了。
我用purdy的三把刷套装,1寸,1.5寸angled和2寸平的。$19.97比单买便宜得多,最重
要是质量好。另外又买了一把purdy刷primer的。每次用完一定要温水洗干净,甩掉水
,晾干,装在套套里。 |
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b*******c 发帖数: 20683 | 6 primer 和primer也不一样,我发现效果最好的味道最大最刺鼻。我挑效果差一点味道
小一点的,2遍就2遍吧。不过我家颜色没那么深,一遍都够了,再说盖的差不多就行了
,一上漆,稍微没被primer完全盖住的,一般都会被paint盖住,我家是这样。我一般
是2遍,一遍primer,一遍正常paint,或2遍2合1的paint。 |
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q**i 发帖数: 1293 | 7 请问有推荐primer的么?
另外刷primer是先刷primer好呢,还是象ls的这样把paint和primer混合在一起一起刷
? |
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A******D 发帖数: 1075 | 8
flat
没听说egg shell要加coating。flat不用primer是说,在旧的flat paint上刷新的漆,
不用加primer。eg-shell要primer,是说要在旧的egg shell上刷新漆,需要primer,
或者要sand。这是我原先研究刷漆时的心得。你赶快去网上研究下,不要被忽悠去4000
元。去HD找egg-shell,flat的漆,看上面的说明。 |
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m********n 发帖数: 3558 | 9 SW Harmony? SW 店里的人说 harmony 没有 primer + paint in one 的
要想 primer +paint in one 在SW 店里只有 emerald.
我harmony 和 emerald 都用了。harmony 的paint 觉得一点味道都没有.LG 敏感也没
有觉得有味道, emerald 可能有味道,但是不确定,因为我还是先上了一层primer 再
上的 emerald -- 以前墙颜色深。 不知道是 emerald 的味道还是第一层 primer 的。 |
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i*******d 发帖数: 1430 | 10 我的实际经验证实,primer不是必须的,把浅颜色刷成深颜色显然不必要,把深色刷成
浅色也没必要。直接刷上两层漆足以,反正就算上了primer你一遍也未必刷的均匀。只
要你用的漆不太烂都行。反正我用HD,Lowes这些地方的漆都没问题。
唯一可能想到的primer的用处就是那些用所谓好漆的,太贵,只能刷一次,这样用
primer可能能省点钱。
may |
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A***a 发帖数: 196 | 11 It has more pigments than white primer. I used it to change dark red ceiling
to white, one coat of gray primer and 2 coats of white paint worked pretty
well.
So grey tinted primer is better than white primer? Why? |
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p****g 发帖数: 1254 | 12 http://answers.yahoo.com/question/index?qid=20100115094517AARd7
I happen to have a professional painter of 22 years sitting right beside me,
so I showed him your question! This was his response:
In most cases you actually don't need to use a primer if you are covering a
clean wall that was previously painted with latex, primer is really only
required when you are going from a oil based paint to a latex or a high
gloss finish to a matte finish. So, you can save yourself time, money and
effort by ... 阅读全帖 |
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m*****3 发帖数: 13701 | 13 不是高人,只不过自己刷过几次自家的油漆。这块油漆出问题多久了,是一点一点积累
起来的还是突然一下就起来了?贵宅是不是挺年轻?上次刷油漆有多少年了?俺猜是上
次刷直接用的二合一油漆 - 就是paint+primer混在一起的,这玩意儿时间短还成,过
几年就没戏了,有可能大片脱落。最好的就是先整个来一遍primer,然后再paint,那
就高枕无忧了。其实你可以判断出来,这块油漆掉了以后,墙是啥颜色?是白的就有可
能是primer,那我就猜错了;要是那种灰不拉吉的那就是drywall本身的颜色,就是当
初没有刷primer,所以沾不结实,要那样的话,估计盖房子时就这样,贵宅每个房间可
能都差不多,下次刷漆可有干的了。 |
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f**e 发帖数: 3156 | 14 你们仔细想一下,上primer就能挡住油吗?根本不可能。对这种板,根本就只能上油漆
,不能上水漆
:paint才需primer, stain不需要primer
:
:【 在 JSIS (YZ) 的大作中提到: 】
:: REDWOOD居然要先刷PRIMER然后再刷STAIN AND SEALER.
:: 怎么办,DECK几乎刷完了。。
:
:
…… |
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c****i 发帖数: 921 | 15 找了几个contractor,有些说法不一,被搞糊涂了
1. 用primer的问题: 有个说全部地方都要上primer, 有的说只有漏原木的地方才需要
,并且现在的油漆都是二合一,已经包括了primer
2.网上有人说要刷两遍油漆(不是指primer),但contractor都说是一遍,因为喷枪是来
回走,实际上已经多于两遍了。要两遍的话,再加钱。
3.一般包不包括大门(不是garage door),有的说包括,有的说by default,不包括。
谢谢!!! |
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l******2 发帖数: 5522 | 16 【 以下文字转载自 Automobile 讨论区 】
发信人: ljiiuan2 (文刀兄), 信区: Automobile
标 题: DIY: 自己喷漆到一点小麻烦
发信站: BBS 未名空间站 (Sat Oct 22 15:36:06 2011, 美东)
前几天不小心擦到了马路牙子, 前面bumper的一小角擦破了点皮。 这个周末打算自己
DIY, 把漆给补上去。 买了砂纸, primer, 油漆, clear coat。
花了九牛二虎之力, 把擦破皮的地方打磨光滑,然后上了一层primer, 可能有点厚,
等了1个小时,准备喷漆。 一喷上去, 好像油漆就把原来已经干的primer给冲刷掉了
, 然后油漆根本不能在塑料bumper上附着。
请问这是为什么?
现在又重新打磨, 上primer。 打算收到大牛建议后再上油漆。 |
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g******r 发帖数: 512 | 18 1.准备工作非常重要,也最花时间拆掉所有开关COVER,钉子等,补腻子,上TAPE,等腻子干了,用沙纸磨光, 用抹布把墙面擦一遍,保证没有灰尘.
2.primer不能省,特别是原来的颜色深色改浅色
3.primer干了,上第一道PAINT;
4.第一道PAINT干了,用沙纸磨一下 (按BM的老板教的);
5.上第2道PAINT
6.第2道PAINT干了,拆TAPE,用小刷子把可能漏掉或者不整齐的边边角角,门框边等再补一下.
7.每次刷primer,加2道PAINT时,用小刷子先把门框边,边边角角先刷一道 (这个比较花时间), 再用大滚子大面积刷;
8.最后,最重要的: 好工具! 滚子和刷子,去BM让老板推荐那种CONTRACTOR用的,贵一点,但是效果绝对事半功倍!
最后的建议; 挑选颜色最最最重要! 万一颜色涂到墙上不是你想要的效果, 家里的长工是绝不会同意再刷一次的。
另外,油漆我家用的是BM的,primer是HD买的大桶的。
很多BM的油漆店都可以给10%off (if you ask); 还一家油漆店sherwin williams也给10%off。 |
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T**r 发帖数: 7016 | 19 一般的程序,不管漆什么东西,如果想要油漆附着得好,一定要上epoxy或者sealer之
类的东西,这样油漆上上去之后才能持久。比如说漆户外的木头表面,如果不上primer
,日晒雨淋的可能不到一年油漆就会起泡脱落。primer就是一种胶,作用就是把木头表
面封住,不让水气进出,这样油漆附着在primer上面会更长久。
我想你的这个船也应该一样,先打磨,再上marine primer/sealer,然后再上漆。 |
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f*********n 发帖数: 11154 | 20 http://www.ammoland.com/2010/10/13/surplus-ammunition/
The term “surplus” simply means an over supply; yet when used in
conjunction with militaria or pretty much anything to do with the
military, it often evokes used equipment or to some a substandard
product.
This most certainly isn’t the norm when discussing surplus ammunition,
and in fact, a lot of military ammo could be considered far superior to
the commercial grade ammo in the same calibers.
...
Today surplus ammo comes in many shapes, siz... 阅读全帖 |
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x*7 发帖数: 11281 | 21 免责声明
复装有风险,请谨慎入市
1.关于full length sizing,全长整型
我用的是LEE RGB die set,希望自己的方法简单,
高效,而且低成本,所以我在用过LEE的润滑剂以后,
决定使用一些低成本的方法,比如机油和羊毛脂,
试用机油以后,我遇到了机油难清洗的问题,上次我也在
这里问过怎么去机油,后来我发现用DAWN的洗碗剂
就很好,关键是不要用太多的机油,刚开始试用机油的时候,用量太多,把弹壳都泡在机油里面,结果弹壳上很多
机油,润滑效果虽然好,但是很难清洗干净,press上面也到处是油。后来,我又试过泡一批弹壳,先把一个泡过油的弹壳做整形,后面跟四个没有泡过机油的弹壳,还是同样的问题—— 机油污染,难清洗。
这么折腾了几次以后,我想,是不是可以试着少用一点保证一样的效果,就试着用一个ziplock的袋子把一百多弹壳装里面,然后放1ml的机油,封好袋子以后揉搓,尽量让每个弹壳的表面都抹了机油,再把一个弹壳里面灌一些机油,大概1ml左右,直接在die里面,打掉底火,让那个顶底火的针表面都糊上些机油。
其他的弹壳,按照往常的方式,顶底火,做整形。
完成的弹壳直接扔... 阅读全帖 |
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J*K 发帖数: 191 | 22 祝贺你买了Dillon. 这个tumbler很好,皮带,胶圈老化也得要七, 八年, 电机不超载
的话,十几年都不会有问题。
9mm 124Gr JHP的弹头不错, 别看小箱子不大, 那可将近70LB, 估计邮差不会高兴的。
你可以再买几个primer tube. Federal primer有点软, 一定要小心处理. Winchester,
CCI 的primer比较硬. 捡primer的时候要带护目镜。
很多牛眼射手喜欢Hodgdon titegroup, 你可以试试Hodgdon HP38. Powder valley的价
格不错,等你确定配方后,搞个8LB的。 |
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P*******s 发帖数: 465 | 23 前几天刚抢到10k federal small pistol match primer。本来federal small pistol
primer 还有,俺加到shopping cart,google 了一下match primer和普通primer的区
别,然后checkout,普通的就没了。贵就贵点吧,总比没有好。 |
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y***n 发帖数: 114 | 24 靶场要求底火不含铅的,室内怕污染。这里是他们网站上的:
CLEAN AMMO POLICY - CENTER-FIRE PISTOL ONLY!
· Pistol ammunition brought into the range must be of the clean primer
type.
· Clean primer ammo is defined by non-leaded and/or non-mercuric primers.
· It must be in readily identifiable factory boxes that display this
information.
(i.e., Winchester = "WinCLEAN", Remington/UMC = "Leadless", Federal = "Toxic
Metal Free Primers" ) |
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l******8 发帖数: 4133 | 25 sephora的vib来的,一套7块~ 眼部嘴部primer很耐用,能用很久
PRIMED AND PORELESS FACE PRIMER - 0.17 OZ
LIP INSURANCE LIP PRIMER - 0.12 OZ
SHADOW INSURANCE EYE SHADOW PRIMER - 0.11 OZ |
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r********m 发帖数: 593 | 26 接着上一楼各种杂牌东东...
=== Lab series === 图1
Age rescue water-charged gel cream tube
A74
Size 15mL
Value 15.00
Price 1.00
Buy this, get all 4 samples free
*** Free samples ***
Lab series Age rescue face lotion
Size 2mL
Lab series Age rescue eye therapy
Size 1.5mL
Lab series Daily moisture defense lotion SPF 15
Size 2mL
Lab series Daily moisture defense eye balm
Size 2mL
**********************************************************
===Lancer=== ... 阅读全帖 |
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G***a 发帖数: 27294 | 27 (3) Monistat Soothing Care Chafing Relief Powder-Gel可以当primer使用,在上粉
底之前用它,效果堪比最贵的primer
Tip 3: “I may have actually read about this on this blog, so you all may
already know, but Monistat Chafing-Relief Powder-Gel makes a great makeup
primer…. I use it under foundation and under my eyeshadow, and it works
just as well as, if not better than, the really expensive primers.”—
bittersweet88
water
related |
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c**********l 发帖数: 177 | 28 妆前乳就是primer,传说可以在皮肤和彩妆品之间形成保护层,增加皮肤润泽度光彩度,
让我们更容易上底妆.有品牌的primer会有不同的颜色,比如make up for ever, 可以修
饰脸部肤色不均.La Mar神奇面霜据说也有primer的作用...
一般primer都可以修饰毛孔,用绿色涂在痘痘部位然后再上遮暇效果就会很好,因为绿色
可以很好地中和红色.黑眼圈或者暗沉的部位应该用紫色的妆前乳修饰.眼下如果有青绿
色血管需要用蓝色来中和.如果皮肤苍白可以用粉色来增添好气色.
不过话说回来如果不追求专业效果可以只挑针对自己最大问题的妆前乳,毕竟买那么多
颜色几年也用不完.
我本人在用la mar面霜+make up for ever绿色,长草紫色中...发现鼻翼和嘴的周围比
较暗沉... |
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C*****3 发帖数: 4215 | 29 其次请细细推荐以下产品及色号:
隔离霜 - Smashbox photo finish light or laura mercier foundation primer
foundation - cle de peau silky cream foundation, 色号估计o20比较适合
compact powder or loose powder - cle de peau
定妆粉 - laura mercier loose setting powder transelucent
highlight - laura mercier highlighting powder
liquid eyeliner - prestige black
唇彩 - cargo, 建议淡粉或者橙色的都可以, 有那种2色的或者4色的盒子
腮红 - mac, nars, benefit
眼影,我要化裸妆 - urban decay naked! or any urban decay 大地色的眼影
和任何你认为化妆需要的东西,例如化妆水(不知道这是什么,所以也不知道是否需要)
并且告诉我在哪里买,价格如何,请... 阅读全帖 |
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z*****e 发帖数: 1442 | 30 之前用smashbox家primer light的那款,然后用Chanel Vitalumiere粉底液,一开始感
觉有点妆感,然后上班到了下午,感觉越来越好,越来越贴。估计是出油了。一切挺满
意的。
后来那款light的primer用光了,想尝试新货的我换了同样Smashbox家的color
correcting blend,红色的那款primer,粉底液继续Chanel和GA家的。悲剧诞生了,刚
涂完的时候没啥,到了办公室后越来越差,开始浮粉了,皮肤也摸上去有点毛毛的了。
话说这款primer,我光涂它本身就搓泥。后来不涂了,直接上粉底液,还是浮粉啊浮粉。
平时用的乳液没有发生什么变化,莫非是秋天太干皮肤出现这种状况?麻烦jms给点建
议。。。 |
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r******t 发帖数: 629 | 31 我觉得么,光靠倩碧的黄油保湿是不够的,貌似你还需要更保湿的霜。
另外就是抹得实在太多层了,那个EL的粉饼是粉状的粉底吧?并不是散粉吧?拿来定妆
会不会太over了?
另外一点,fundation不是拿来遮瑕的,只是用来均匀肤色。如果完全靠粉底遮瑕,会
变成很可怕的面具妆啊~~所以抹的时候都要抹少一点啊~而且要抹匀,set之后才能
进行下一部。
如果你用giorgio armani的粉底,我觉得最好用它家自己的master primer,我觉得用
其他的牌子的primer都不如GA家自己的这个primer贴合度高。而且这个primer感觉很水
水的,不油腻,有很高的持妆度。
另外,GA的fuandation一定要用GA自己的貂毛刷子上才上得均匀,而且要一点一点慢慢
上,不要一次到位,而是一层一层的叠上去。试过这个刷子才知道可以上得多么薄多么
匀。一般的fundation brush都会上得偏厚。不过那个beauty blender还是很赞的,一
定要湿润以后用才有效就是了。
http://www.giorgioarmanibeauty-usa.com/blender-brush/A074... 阅读全帖 |
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l******o 发帖数: 3764 | 32 反馈一下,Methyl Primer Express® Software v1.0貌似不能做methylight的
primer啊,只能做那种一对methylated primer,一对unmethylated primer的PCR
google了一下,methylight貌似需要那个叫 beacon designer的软件
不知道是不是我理解有错@@
还请牛人指正 |
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c******r 发帖数: 3778 | 33 sybr green也可以,但是需要分开跑。
sybr green是个non-specific的DNA double strain dye.就是说,只要是PCR产物都可
以stain。所以没法用multiplex reation做internal control。
如果用taqman,pcr效率不错的话,可以设计两对primers,一对测你的target
sequence,一对做个其他随便什么基因的sequence。分别用不同的颜色标记。这样在一
个样品里跑两个pcr。如果如果target sequence是control的50%(一般给+-20%的误差
)就是single copy。如果和control一样(也是20%误差)就是two copies。
如果你的primers设计比较好,两对的amplification efficiency非常接近,那么可以
直接用ct数来计算二者的关系。但是如果两对primers的效率相差比较多,那么只能每
次都分别给两个primer做standard curve。这样保证二者的定量可比,也是可以的。就
是麻烦点。 |
|
d******u 发帖数: 178 | 34 同鞋,貌似这里有些基本的东西不太清楚呀。
用ABSOLUTE还是RELATIVE要看你不同PRIMER的扩增效率。如果前期已经做过PRIMER的优
化,相比较的两个PRIMER的扩增效率大致相同,可以直接用RELATIVE QUANTIFICATION
。如果没有做优化,也不想花功夫做优化,可以用RELATIVE ABSOLUTE QUANTIFICATION
,就是两个PRIMER都分别做标准曲线,通过标准曲线转换出的数值进行RELATIVE比较。
单纯的ABSOLUTE QUANTIFICATION一般用得不多,在需要知道目标TEMPLATE在样品中准
确的量的时候用。
我猜大概你的情况是RELATIVE ABSOLUTE QUANTIFICATION吧,分别做标准曲线就可以了
。 |
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c*********r 发帖数: 1312 | 35 如果Forward primer --> reverse primer 的方向和mRNA 5' --> 3'的方向是一致的。
Forward primer: sense probe
Reverse Primer: anti-sense probe
总之,靠近上游的promoter,转录sense Probe;靠近下游的promoter,转录anti-
sense probe。 |
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m***o 发帖数: 272 | 36 谢谢wenqian and chamgrape。
1.如果gene有很多不同的转录起始点,那这些都是capped的吗?如果miss掉了ATG那岂
不是造成能量的浪费了吗?
2.direction 可以确定是对的,不太明白怎么可以方向不对,因为kit里面是forward
primer, you have your gene specific primer as reverse primer.
pubmed里那么多的gene都是primer extension得到的全序列吗? |
|
k****o 发帖数: 589 | 37
control
可能要做ChIP,所以想把这个问题搞清楚点。不知道你所说的control是不是指:
第一组(用特异性抗体沉淀):
1. 已知结合序列的primers (positive)
2. 已知不结合序列的primers (negative)
第二组(用IgG沉淀):
3. 已知结合序列的primers (negative)
4. 已知不结合序列的primers (negative)
一共四个样品做control,对吗?多谢 |
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z*******a 发帖数: 175 | 38 should be
1. 特异性抗体沉淀,已知结合序列的primer pair A (targeting enhancer or
promoter of interest, positive)
2. 特异性抗体沉淀,已知不结合序列的primer pair B ( targeting
transcriptionally active region, negative)
3. serum or IgG沉淀, primer pair A (negative)
4. serum or IgG沉淀, primers pair B (negative)
first time,
you need 1, 2, 3
you may include 4, but nobody cares
after established (working antibody and optimized conditions), you only need
1&2, or 1&3
need to be prepared to get involved. much complicated than other routine... 阅读全帖 |
|
w******e 发帖数: 1187 | 39 I don't know how to do PCR in this case, as I have 0 idea what the sequence
is (so no primer available on either end).
I meant to use the random primer to do one round of primer extension. Maybe
I can add some tag to the random primer to enable PCR? any thoughts? |
|
b***8 发帖数: 31 | 40 From Promega:
Due to a sequence
difference between the T7 Promoter Primer (Cat.# Q5021) and the T7 RNA
polymerase promoter in the pCI-neo Mammalian Expression Vector, the T7
Promoter Primer cannot be used for sequencing these expression vectors. The
sequence difference is downstream of the transcriptional start site and is
located at the 3′-end of the T7 Promoter Primer. The T7 EEV (Eukaryotic
Expression Vector) Promoter Primer (Cat.# Q6700) has been designed
specifically to prime sequencing rea... 阅读全帖 |
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s*****g 发帖数: 87 | 41 For qPCR, primers need to be specially designed to avoid the formation of
primer dimer and smear.
you can try the primer designing tool from IDT and redesign your qPCR
primers, which are the most important thing for a successful qPCR.
http://www.idtdna.com/scitools/Applications/RealTimePCR/ |
|
w********r 发帖数: 1431 | 42 negative control primer的选择还是很tricky的.
同样的IgG和Ab的sample,
有些negative ctrl的primer就很好,有些primer不管怎样都会有signal,很恼火。。
。你可以试着选择intron的地方设计primer试试看。
至于结果分析,你可以去找几份最新的ChIP的paper看看,
用qPCR sample(IgG和Ab)的CT值和1%input DNA CT值,
算出分别是1% Input的多少倍。然后再算ab vs IgG有多少倍的enrichment |
|
b******r 发帖数: 111 | 43 Sorry for this confusion.
It is too early for me to talk about transgenic mice. I am just during
electroporation of construct into ES cells. My Southern doesn't work for
genotyping. I have to use PCR to isolate positive ES cell clones. Then I
need get a primer pair for genotyping. Forward primer is from Neo, reverse
is from outside. What I did is knockin,not knockout.
Without purification of genomic DNA(just heat to kill proteinase K),PCR
doesn't work. After purification, still doesn't work.
"你... 阅读全帖 |
|
l***s 发帖数: 841 | 44 That's weird. We have tried thousands of primers from the database, and they
mostly worked well (>90%). As to isoforms, the primers were designed to
cover all known isoforms of a gene based on NCBI RefSeq. This was done by
designing primers from the common regions of all isoforms. Not sure why your
Ct values are low. Did you follow the protocol from the website (primer
conc, annealing temperature, etc)? Another consideration is that not all
genes are expressed in all cells.
WELL |
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n**********u 发帖数: 77 | 45 我最近用promega的Gotaq酶做pcr,然后再TA克隆。 情况是这样的:我循环是40,后面
有10min 72度extension.但是就是连接不上,pcr product跑胶后的条带是很亮的。 我
怀疑是我的TA kit的问题,但是也不是,因为我把我的pcr products 中浓度较弱的几
个当作template再来一次short-pcr后(15cycles,然后10min 72度extension)得到的
产物回收再做TA克隆,得到满板。这说明我的TA克隆是正确的,就是pcr的问题。 我怀
疑是开始的循环数太多了,就降到35个循环,但是还是不行。 后来我又怀疑是我的酶
和体系出问题了,pcr的产物可能没有加上A尾,我加大酶量和dntp的量。 但是还是不
行。我后来又做了加A尾的实验,换了fermentas一般taq酶,也还是不行。大家说可能
是什么原因。
我的pcr体系:
20ul体系
H2O 9
5*GoTaq color buffer 4
dNTP(2mM) 2
mgcl2(25mM) 1.6
BSA(100mg/ml) 0.15
... 阅读全帖 |
|
A******y 发帖数: 2041 | 46 Wrong! Efficiency will affect ddC(t). I give you a hint, my old lab used
to troubleshoot for invitrogen RT-PCR mix and we mostly use ddC(t). A
primer that is not in its linear range behave erratically with no tread to
follow. I have seen non-linear primers not moving C(t) at all or with lower
C(t) when there are more cDNA.
I know a lot of people don't check their primer efficiencies, and now you
see why people think there are so much BS in the bio-field. You are doing
your experiment WRONG.... 阅读全帖 |
|
m*********D 发帖数: 1727 | 47 他science文章的protocol里是puromycin七天,然后是drug treatment七天或十四天。
要整合的话(stable cell line),时间是该差不多了。
你说的先作Cas9的stable我要考虑一下。就是作stable cell line太花时间。Cas9的表
达silence问题该不大。一般stable在我手里是三个月之后才出现基因表达走下坡。
Lentivirus感染效率高的话,一个vector省很多事啊。上次作点突变,我用普通的
lipofectamine 3000作transfection, 效率太差,少于10%的细胞能在三天的puromycin
selection后活下来。也许我用的puromycin量太高,2.5ug/ml。当时作了一个三天的
killing,找到能三天杀完host cell的最低量,就用上了。
再向你请教一下:vector整合进genome后,拿到genomic DNA,再用primers来扩增整合
的guide Sequences。这对PCR primers 就是直接从vector来的吗?我想象这对primers
正好在gu... 阅读全帖 |
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H**T 发帖数: 3007 | 48 脑残还是咋地?!阅读水平这么差还做科研,还出来现?!
人家讨论的是最小的band,是primer dimer! 不是中间的bands.primer dimer是50bp左
右的band,明白了吗?primer dimer当热不是editing的产物!
didi @monkeydidi Jul 15
@GaetanBurgio That looks promising. What DNA ladder did you use? Is the
smallest band in wildtype control primer dimers?
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Gaetan Burgio @GaetanBurgio Jul 15
@monkeydidi 50 bp ladder. smallest bands are dimers, not editing.
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didi @mon... 阅读全帖 |
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o****t 发帖数: 242 | 49 我用了GAPDH两段序列作为 housekeeping gene endogenous control,去检测一个
gene的表达正常还是deletion,结果出来一个正常一个deletion。
用的是 ΔΔCt的方法,Ct平均值都在21,22左右。
我之前一直用的是一对GAPDH primer,这次做的时候想test一下第二对primer。出现这
个结果不同的情况之后,我又用第二对GAPDH primer去检测了之前我做的其他case(用
第一对GAPDH primer作为endogenous control)比较表达的不同的,结果都和之前的结
果一致。
请教各位高手,如果你们碰到这样的问题,怎么解决呢?多谢。 |
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w**********y 发帖数: 1691 | 50 哦.那就不敢班门弄斧了.我自己是2年前从零开始入手的.纯是初学者的体会.
primer和primer plus都看过几遍..plus感觉有点太简单和不着要点..感觉primer要好
很多.当时我刚看了几遍cplusplus能写一点小程序了,所以看起来还好.
基本上我CS的朋友都是强烈推荐primer和thinkinginC++.. |
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