s******y
发帖数: 28562 | 1 你是问体外还是体内情况？
一般而言有这几种情况：
１。离子：Mg2+, ATP, K+ 促进G-actin -> F-actin,
Ca2+, ADP, Na+ 促进F-actin-> G-actin
2. 附属蛋白（按正常情况下的重要性排序）：
（1）切断F-actin 的蛋白： such as gelsolin
(2) 阻断F-actin plus end 的蛋白， such as capping protein
(3) 隔离G-actin，导致有效浓度降低的蛋白，such as thymosin beta-4
你做的那个蛋白有可能类似第（3）种。
G-actin 含量的提高会影响到很多蛋白的代谢，一个最常见的例子就是
serum-response-factor (SRF)，这个蛋白本身是一个transcrption factor,
它能直接感知G-actin的含量（有结合力），调控一些非常重要的基因。
actin |
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s*******2
发帖数: 598 | 2 See below 1997 paper
Biochem J. 1997 Apr 1;323 ( Pt 1):233-7.
Actin is cleaved during constitutive apoptosis.
Brown SB, Bailey K, Savill J.
SourceDivision of Renal and Inflammatory Disease, Department of Medicine,
University Hospital, Nottingham NG7 2UH, UK.
Abstract
Proteases play an important role in the programme of cell death by apoptosis
but little is known of the substrates cleaved, particularly in constitutive
models of this type of cell death. Neutrophils spontaneously undergo
apoptosis ... 阅读全帖 |
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M*****e
发帖数: 279 | 3 我有类似的经历：检测不到一个ATCC cell line 的 beta-actin。
Cell line: SW780 (human urothelial carcinoma).
I bought this cell line twice from ATCC, but I could not detect beta-actin
at all. The expression of beta-actin as shown by Western blot in this cell
line was reported in the literature.
I could detect GAPDH in this cell line.
I could use the same beta-actin antibody (Sigma) to detect beta-actin in
other human cell lines (urothelial and non-urothelial carcinoma) using the
same antibody (Sigma).
I don't thin... 阅读全帖 |
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k******0
发帖数: 1073 | 4 近来研究一个g－actin的结合蛋白，但不知有啥功能。哪位能够接受一下g－actin
pool的生理作用吗，即在正常生理情况下，什么因素会促进F－actin解体形成g－actin
？g－actin的含量提高，会影响到细胞蛋白质代谢吗？
谢谢大牛们解答。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 5 核里到底有没有actin 一直是领域里面在争吵的问题，
好像是有ARP (actin-related protein)，然后据说在某些特定情况下
actin 会进去。
当然，肯定不能用用这个作为loading control.
using sigma actin ab (the strongest one out there) you can barely see a
band while the cyto is like 1 sec exposure...Submit your paper with actin as
nuclear loading control, let's see what the |
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m******5
发帖数: 1383 | 6 I happened to be reading a review article published 1 year ago talking about
that actin play a very important role inside cell nuclear, by recruting
Nuclearsome remodeling complex or stablizing pre-mRNA.
But there isn't any NLS harbored on actin, and it has been proved that actin
can not migrate into cell nuclear on their own. So, how come a little
amount of actin leaking into cell nuclear can have so significant function?
On the other hand, did anyone ffind that different isoforms of actin have... 阅读全帖 |
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k******0
发帖数: 1073 | 7 您的试验说明了：
1。 GFP抗体优于actin的抗体。同样的蛋白量，GFP抗体可以轻易监测到，而用actin抗
体比较费劲测定。
2。内源的actin表达量远高于GFP－actin的表达量。所以用actin抗体可以容易检测到
43kDa
的蛋白带，而较难检测到70kDa的带。
即使尝试其它办法，可能也是得出同样的结论。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 8 我对你们用的药不熟悉，刚才上网查了一下，这个药物对F-actin 有已知的破坏作用，http://www.nature.com/cdd/journal/v5/n7/abs/4400392a.html
但是对monomeric actin 到还没有报道过有什么效果。
Actin 本身是一个非常稳定的蛋白，half life 超过24小时。如果居然彻底消失了是个
很蹊跷的事情。
对于你们的实验，首先，先试用其他loading control, 不要耽搁你们的实验了。
然后对于actin 消失这件事情，再采用其他方法来测试看看是不是你们的细胞系
有非常强的杀灭作用，或者象其他同学建议的那样，是不是转换成其他类型的细胞了。
另外就是注意一定要有positive and negative control during western blot.
前一阵子我实验室里的人也嚷嚷说actin band 看不见了，后来我去仔细查了一下，其
实就是二抗坏掉了而已，换一个新的就什么都出来了。 |
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m******t
发帖数: 109 | 9 最近做到F－ACTIN。 以下是我的理解，请确证。 ACTIN有３大ISOFORMS，alpha, beta
,gamma, 是MONOMER， 统称叫G－ACTIN。 组装成束状，就是F－ACTIN。 可是还有F－
ACTIN ，识别的是什么？
请指教 |
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a******1
发帖数: 116 | 10 我转染了eGFP-actin 到HL60细胞系，在荧光下观察转染效率大概是40％－50％，用
western检测的时候：GFP的抗体可以在70kD左右检测到GFP-actin的条带；但是actin的
抗体没有70kD的条带，只有自身的43KD的条带； 请问有人碰到过类似的情况么？有什
么解决方法呀？多谢
另，已换了两个公司的actin的抗体，都只得到一条带 |
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s******y
发帖数: 28562 | 11 如果你要认真做的话，应该这么做：
用anti-GFP 来pulldown GFP-actin, 或者直接在细菌里表达GFP (or GFP-actin, 没有
活性没关系，反正是用来western), 或者直接到公司买点GFP standard protein
sample.
然后先跑胶用蓝染或者银染，对照已知浓度的BSA 来测定浓度，然后用这个GFP (or
GFP-actin)来作为标准浓度来对比你的细胞里面的GFP-actin来估算浓度。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 12 actin patch, actin cable, actin meshwork,actin cloud... |
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k******0
发帖数: 1073 | 13 Sunnyday太赞了，非常谢谢。
如何得到稳定的g－actin？我用LatB获得单体，但好像单体actin不稳定，几天过后就
开始沉淀。可以液氮冻起来吗？
你有没有表达过non－polymerisable mutant actin？用于reconstitute protein
complex。 |
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a******1
发帖数: 116 | 14 最近正在搞这个，
把actin, GSH, H2O2混一块儿，跑western, anti-actin, 结果除了actin自身的条带还
有一个分子量小一些的条带；
只把actin和GSH混一块儿就只有一条正常的带；
一直没想出个合理的解释，请问版上的大家有何高见哇～
多谢 |
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a******1
发帖数: 116 | 15 最近正在搞这个，
把actin, GSH, H2O2混一块儿，跑western, anti-actin, 结果除了actin自身的条带还
有一个分子量小一些的条带；
只把actin和GSH混一块儿就只有一条正常的带；
一直没想出个合理的解释，请问版上的大家有何高见哇～
多谢 |
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A******y
发帖数: 2041 | 16 There is actin in the nucleus? I did a lot cyto and nuclear extracts and using sigma actin ab (the strongest one out there) you can barely see a band while the cyto is like 1 sec exposure...Submit your paper with actin as nuclear loading control, let's see what the
review will say. |
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y****z
发帖数: 27 | 17 isn't actin associtaed with microtuble ? since mt is there, why actin can't
about
actin |
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s******y
发帖数: 28562 | 18 很正常。
我从来还没有见过哪个actin 抗体能够识别 GFP-actin的。 我的猜想是因为
GFP 是一个很难打开的球形蛋白，所以会挡住很多抗体。
另外，actin 的N和C端距离得不远（球形蛋白）。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 19 如果你一定要做的话，可以用GFP抗体把 GFP-actin 拉下来，然后用anti-actin 把
actin 拉下来，然后跑胶对比 |
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s******y
发帖数: 28562 | 20 如果你一定要做的话，可以用GFP抗体把 GFP-actin 拉下来，然后用anti-actin 把
actin 拉下来，然后跑胶对比 |
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i***l
发帖数: 1656 | 21 你这样设计已经不准确了 因为Actin抗体和Actin，GFP Actin的结合强度不一样 你怎
么基于这个比值看蛋白Ratio？ |
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k****o
发帖数: 589 | 22 像楼上说的，tag和actin之间加段短的酶切位点。
你的actin抗体显然不适合直接pulldown GFP-actin融合蛋白。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 23 LZ
title 要改成
'召唤sunnyday 师姐/兄 G-actin和F－actin的转化受什么因素控制的？'
就会马上有答案啦 |
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s*****e
发帖数: 1 | 24 怎么能看到细胞内G-actin and F-actin含量的变化？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 25 很多种方法，比方说有很多试剂是专门染色F-actin 的。
还有一个常用方法就是把细胞裂解了进行高速离心，
F-actin 会沉淀下来。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 26 G-actin 需要保存在G- buffer( Ca+, EDTA, ATP, Na+, DTT)里（你可以去查
google 看配方，否则很容易变性。
加上适量grycerol 之后可以保存在液氮里。
non－polymerisable mutant actin我做过几个版本，一般都很容易变性，
所以保存在液氮里是对的。 |
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k******0
发帖数: 1073 | 27 Sunnyday， 谢谢你的指点。
你是否还有mutant actin的质粒，能否向你要些？
这些mutant actin在E coli中表达如何？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 28 很抱歉我是在研究生院的时候做那些事情的了。后来搬了好几次家之后，
不知道怎么的很多质粒都找不到了。
另外，Actin 在E.coli 中表达后一般都是没有活性的（因为actin折叠需要
一些特殊的chaperon)。
等我有空的时候可能会试试一些新方法，如果能做出来会让你知道的。 |
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S*********s
发帖数: 304 | 29 既然你做这么specific的实验，想必你在做protein S-glutathiolation的研究
可能的解释就是
GSH+GSH（+H2O2）->GSSG
Actin+GSSG->Actin-SSH
但有两个问题
1）你跑了Western,正常情况应该加了DTT,不应该看到modified actin
加DTT多煮煮，看看是否还在
另外，可以coincubate with IAA or IAM,do IEF，you should get more information
2) 一般来说band should go upshift, 但你看到了downshift,所以不敢肯定
这种情况时有发生
If it is really S-glutathiolation, you should go in vivo.
1)Check whether this modification happens under physiological and
pathological or drug treatment conditions.
2)Whether it is functional
Goo... 阅读全帖 |
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S*********s
发帖数: 304 | 30 既然你做这么specific的实验，想必你在做protein S-glutathiolation的研究
可能的解释就是
GSH+GSH（+H2O2）->GSSG
Actin+GSSG->Actin-SSH
但有两个问题
1）你跑了Western,正常情况应该加了DTT,不应该看到modified actin
加DTT多煮煮，看看是否还在
另外，可以coincubate with IAA or IAM,do IEF，you should get more information
2) 一般来说band should go upshift, 但你看到了downshift,所以不敢肯定
这种情况时有发生
If it is really S-glutathiolation, you should go in vivo.
1)Check whether this modification happens under physiological and
pathological or drug treatment conditions.
2)Whether it is functional
Goo... 阅读全帖 |
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a******1
发帖数: 116 | 31 是啊，刚开始做这个，好多都不懂，
我的loading buffer里加了b-ＭＥ，92C煮了8分钟; 其中有dtt的sample的确分子量小
的那条band变少了。
贴了个western图：左边是actin(1ug)+gsh(500uM)+h2o2(500uM) 在25ul反应体系，上
样量是1/2, 右边是在此基础上再加了10mM DTT的western 结果 ，anti-actin, 从上
至下第一条band是actin的大小（42kD）,小的大概27，28kD
如果是upshift就好明白多了哇，这是第二次出现这种情况
IEF没怎么接触过，先做点homework去.
多谢
information |
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s******y
发帖数: 28562 | 32 Actin 是一个非常好的loading control, 也是一个细胞生存需要的关键蛋白之一，能
够使得这个蛋白彻底看不见了是一件非常奇怪的事情。除非细胞被药物处理之后
彻底坏死导致所有actin 都被降解了。你说的那个CDDP是什么药物？
Actin
GAPDH, |
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m***m
发帖数: 58 | 33 Re!
48hrs treatment, it might have affected the transcription/translation of
actin or protein degradation in general. Actin is not always stable. I
used to study transcription factors and actin fluctuates a lot. For your
purpose of loading control, I would try all three of them. Tubulin might be
the most stable one. |
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g**c
发帖数: 144 | 34 换一抗试试看？随便找谁借点儿别的公司的。也许药把这个公司的 antibody 所识别的
actin 的 epitope 给搞得认不出了。。。或者甚至直接用药处理 control cell lysa
te，看看 actin 条带会不会消失。
Actin
GAPDH, |
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s*****g
发帖数: 7857 | 35 检查出actin多了只能说你的核蛋白污染了细胞质蛋白.通常要用组蛋白等做LAODING
CONTROL, 再用actin/GAPDH等做污染检测. |
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s******y
发帖数: 28562 | 36 核内的actin 的问题其实目前还不是特别清楚。
一般来说，如果是那种特别大的核（比方说卵细胞的核），往往是有
atin的.至于怎么进去的？目前大家也不是很清楚
about
actin |
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c******g
发帖数: 49 | 37 似乎actin进核是挺普遍的吧，我自己也观察到过，但是也不知道机理以及作用。听过
一个报告，似乎actin进核同某种病毒在核内复制相关。 |
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k******0
发帖数: 1073 | 38 需要制备一些actin单体，有没有那位同学研究actin给个好的建议。谢谢。 |
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E*****1
发帖数: 610 | 39 I cannot get beta-actin, other proteins is ok.
I tried several actin antibodies, none works.
I am thinking maybe semi-dry transfer too long, but 11-40KD marker still
there.
Whats happened? |
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g*********5
发帖数: 2533 | 40 Recently I used actin antibody (sigma) to probe mouse heart sample. no band
observed.
and actin can't recognize mouse muscle samples, too. |
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s******y
发帖数: 28562 | 41 Sigma 的哪个 actin 抗体啊？ 如果是那个针对non-muscle actin 做出来的抗体，
在心脏和肌肉里没有信号难道不是很正常么？
band |
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a******1
发帖数: 116 | 42 那有什么替代方案来检测转染的gfp-actin与总的actin的比值呢？
另外，western不都是一维的了么，怎么还有球形结构； |
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a******1
发帖数: 116 | 43 长曝光确实能看到一条很弱的带，
但我主要是想看 GFP-actin/total actin的比值，这样就不准确了吧 |
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w***a
发帖数: 1053 | 44 抗体不同,pull down的能力也不同
就算都pull down下来考染,看深浅的比值也未必精确
如果是相对的,几个条件的转染,就跑western就行了,把sample稀释一下然后把几个条件
的actin条带调平,然后最大限度load原sample看gfp-actin |
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s******y
发帖数: 28562 | 45 问题是你用actin antibody 看到的那个70kD带未必是真的GFP-actin |
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w***a
发帖数: 1053 | 46 我觉得那就是真的
actin这种蛋白细胞里太多了
远远大于外源性的
如果western把内源性的actin调节的很漂亮的一条带
这时候外源性的很难看到 |
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a******1
发帖数: 116 | 47 我转染的GFP-actin是有点突变的，转染了之后用细胞做了跟actin有关的其他实验；所
以得看比值 |
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a******1
发帖数: 116 | 48 这个想法值得一试，哈哈，多谢；
本来想的是同时用不同浓度的actin和GFP蛋白来做一个梯度，再加上我的samples，分
别用anti-actin和anti-GFP,最后婉转的得出个比值。。。 |
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c********b
发帖数: 363 | 49 可不可以在GFP和actin之间放一个3c protease的site，比较切或者不切情况下actin的
强度（都normalize到GAPDH）变化。 |
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v***a
发帖数: 1242 | 50 以前染的是低密度细胞，F-actin全spread开，纵横捭阖的样子。这次染了高密度的细
胞(10x)，F-actin都变成围绕着细胞核了。大家有见过这样的情况么？谢谢～ |
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