c**k
发帖数: 1228 | 1 my one question:
is the personality of "nice" or "JP"(BT) for Boss determined by gene? does
anyone believe this? if one can identify and clone this gene, that would
benefit a lot of Nanxiong Nandi here.
In the future, when one is going to be boss, should consider first knockout
his/her JP, BT genes, or at least knock-in some nice genes.
hopfully these JP/BT genes does not have a big family or two many homolog,
which makes it difficult to knockout. |
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H*g
发帖数: 2333 | 2 So what homology modeling software/tools have you tried?
(sorry couldn't type in Chinese in the lab) |
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B*******g
发帖数: 70 | 3 现在正在做DNA的翻译，测的序列中夹杂着intron，直接用软件翻译中间夹杂好多stop
codon，用blastx，几个homologs的intron位置竟然不一样。求高人指点！
现在该如何做才能得到去除intron的coding gene？谢谢各位了！ |
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f*****y
发帖数: 464 | 4 现有非人类的基因一个，想看promoter有哪些transcription factor binding sites.
我把该基因和人类homolog基因的promoter sequences都作了TFsearch，结果出来有很
大不同，只有少的可怜的TF同时出现在两个结果里。
我理解这个TFsearch的结果是根据人类的TF计算的。我们这个动物基因组刚测出来，它
的TF binding sequence还不知道。这种情况还有没有办法分析呢？
请支招。多谢。 |
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h***e
发帖数: 146 | 5 http://www.nature.com/nprot/journal/v4/n2/pdf/nprot.2008.227.pdf
Figure 4 | Insertion of a nonselectable DNA fragment by recombineering.
(a) ‘Seamless’ method to insert nonselectable DNA fragment makes use of
selectable markers that can be used for positive as well as negative
selection
(e.g., galK).
Using this method you can change any sequence(From 1 to n bp) in the plasmid
and then homologous recombination into the chromosome. |
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a***e
发帖数: 1010 | 6 (1) for any model organism, you can try homologous recombination to mutate
anything you want.
(2) for model organism like yeast, worm, fly, the best part of them is
genetics. You can do "unbiased" genetic screen to identity anything change
a defined phenotype. |
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c****l
发帖数: 1086 | 7 即使在同一条染色体上还可以发生homologous recombination而组合在一起啊。
只是不能太近，这个几率可以用cM来测量。如果是在同一染色体的两头，重组的几率还
是不低的。
The centimorgan is equal to a 1% chance that a marker at one genetic locus
on a chromosome will be separated from a marker at a second locus due to
crossing over in a single generation
One cM is about 1 Mb apart. |
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k*****o
发帖数: 1486 | 8 当年一个日本人写的PNAS好像把GUCK protein的fructose homolog写成了"那个什么UCK
"
具体想不起来了,老师讲的时候眉飞色舞的.. |
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H****N
发帖数: 997 | 9 How was the KO made, by homologous recombination or gene trapping? Why is
there cre in it? If the mouse is made by gene trapping, it is possible the
gene is not knocked out completely, depending on where the gene trapping
cassette is located. Another remote possiblity is that there is another
related or duplicated gene in the genome, and thus your results. |
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h*****y
发帖数: 10 | 10 It's a homologous recombination deleting one exon. And this gene is a member
of protein family. |
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w******e
发帖数: 1187 | 11 前段时间来求救，做EMSA，连作为negative control的library都bind的一塌糊涂：
http://www.mitbbs.com/article0/Biology/31394721_0.html
得到了大家的很多宝贵建议。综合考虑后觉得自己的protein是形成了aggregate，拖了
n久总算确认
了——见附件图。gel 是4% native PAGE，silver stain，lane 1/2/4是target
protein，
3/5是control（5是homolog，如果没aggregate的话target也该在那个position）。其
中lane
2/4加了0.1%/1%的triton，没区别。另外也试了DTT，也不行。真衰呀。。。
这个target是我side project必须要用的，而且要用大量。好不容易找到家便宜的，还
这么背。。
。还有什么方法可以搞掉这个aggregate吗？更狠的detergent？？请指教！//bow |
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w******e
发帖数: 1187 | 12 3是BSA，5是target的homolog——你说的没错未必跑的完全一样。他们MW和PI都
还接近，我就是要show个类似的protein能成band能migrate其实呵呵。
DTT我只做了一次，加了1mM。不知道还要incubate一阵，土了。。。不过整个
准备过程下来，到把probe加到protein里也已经算处理了近1h吧。然后probe
protein interaction也要1hr+ |
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o********r
发帖数: 775 | 13 homologous recombination + positive/negative selection?
不过俺N年没做过这个了。。。 |
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n********k
发帖数: 2818 | 14 What an AMAZING woman! seriously!! I vote her to be a next Nobel laureate
and a first Chinese and it is a girl too....
http://english.cas.cn/accessory/twows4th/twowsaward/201006/t20100627_55793.html
Professor Fanyi Zeng was born in 1968. She received her B.A. in University
of California San Diego, CA, USA in 1991. In 2005, she got her Ph.D in
University of Pennsylvania, PA, USA.
Professor Zeng has led a research team that has made substantial and long-
lasting contributions to the developmental ... 阅读全帖 |
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y******8
发帖数: 1764 | 15 One sample from google. Good luck!
Dear PLoS Biology editor:
I would like to submit a presubmission inquiry regarding suitability of our
manuscript, "Subversion of cellular autophagy pathway by RNA viruses" by
William T. Jackson, Thomas H. Giddings Jr., Sara Mulinyawe, Ron Kopito and
Karla Kirkegaard for publication in PLoS Biology. Cellular autophagy is a
field that is just entering a period of rapid discovery, because the
mammalian homologs for the many yeast genes that affect autophagy have v... 阅读全帖 |
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D*a
发帖数: 6830 | 16 不是现在有个办法是在大肠杆菌里面Homologous recombination
叫recombineering，以前实验室实习的时候他们弄了9个蛋白，从BAC上弄下来加个tag
再做到cell line上，总体效果还不错。 |
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s***e
发帖数: 911 | 17 1. 这个重组过程, 一定是在B-form dsDNA和RecA-ssDNA之间完成的吗?
2. RecA也可以直接和dsDNA作用, 形成dsDNA-RecA triplex. 这个结构在重组过程中有
任何作用吗? 比如, 重组可以不可以在dsDNA-RecA 和一个空的ssDNA之间发生?
3. 重组可不可以在dsDNA-RecA和ssDNA-RecA之间发生?
谢谢. |
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m********r
发帖数: 124 | 19 唉，我跟楼主情况类似，也是两年半了。做蛋白的，第一个考qualify的时候被人抢了
，第二个纯化出来发现不折叠，好容易有个homolog折叠了，现在老板又不急着让我做
；催我的是另一个课题，结果那个蛋白降解，相互作用也做不成，我觉得怎么不好做的
蛋白都让我遇上了。关键是他催的这个课题性价比太低，因为人家做遗传只是要我们一
个确定相互作用位点，我用核磁得做老久，还取决于蛋白的稳定性，就是做出来了我也
不是一作。头大啊 |
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E**********y
发帖数: 991 | 20 先做个homology alignment不就行了，然后再看看功能能不能用zVAD抑制。底物不好说
，不同的caspase，底物也不同。能够找到能够被这个切或者切这个蛋白的caspase就更
好了，然后考虑是在extrinsic 还是intrinsic pathway上 |
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p*****m
发帖数: 7030 | 21 这个我不太同意。如果按照果蝇/线虫遗传学的思路 就是拿鲍和筛选来彻底搞清一个
pathway 这个老鼠肯定不行，事实上在老鼠里做modifier screen的好像就没有什么人
。但是你完全可以换个思路，screen出来一个hit，只要有意思，大可以接着用biochem
,用genomics的方法把它的上下游找出来接着做。这个时候forward screen找出的那个
hit是最重要的，别的方法替代不了的。
还是原来举的例子。当年Joe Takahashi作mouse screen其实就做了一丁点，就找到了
clock mutant,然后从clock gene出发能找出整套circadian rhythm的mechanism，后面
这部分就不需要genetic screen了，看看啥东西和clock binding,啥东西受clock调控
，blabla,也可以做得很好。但是这个clock gene如果没有forward screen就不知道什
么时候能找出来（当然现在往回看的话，如果mouse people相信fly的结果，完全可以
从fly circadian rhythm gen... 阅读全帖 |
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m*p
发帖数: 226 | 22 DNA sequence may be not the reason. All the cells in the whole organism are
derived from the same fertilized
egg: a cell. Random homologous recombination and random point mutation
happen during the development,
but these do not contributes to the organized or programmed differentiation
process in different organs, and
also does not contributes to the cell identity in different organs either.
After the fertilization, the first cell division in some if not most
organisms is asymmetric cell divisio... 阅读全帖 |
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m*p
发帖数: 226 | 23 It is efficient for them to use homologous recombination to get Cre-loxp
fish? |
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b********i
发帖数: 73 | 24 HSP70 and HSC70 share a very high homology, anyone knows their specific Abs
(no cross reactivity)?
Company and Cat number will be highly appreciated. Thanks a lot! |
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w******e
发帖数: 1187 | 25 比如：有一target有highly homologous protein（且称negative target），如何
改造antibody以确保specificity（不bind negative target）？ |
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w******e
发帖数: 1187 | 26 to answer this question, let's do a "simple" math 1st:
Say you generated polyclone antibody which let's say has only two Abs -- X (
the
"nonspecific" one), Y (the "specific" one). the ratio b/w X and Y is 100:1.
the affinity of both abs against the real target P is 1nM, while the
affinity
against the homolog Q is 10nM for X, but 1uM for Y (hence the specificity
difference). You want to add excessive amount of Q to soak off Ab X so that
the final ratio b/w X and Y is 1:10 instead of 100:1, and th... 阅读全帖 |
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D*a
发帖数: 6830 | 27 定点Homologous recombination?
外行，瞎说的 |
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e***o
发帖数: 344 | 28 感谢各位的回复与建议。
Homologous recombination的想法很好，我也想过用attp,phic31的办法来做，要先置
入attp site, 然后筛选，再接着转化。只是我用的是原代细胞，不能分化。所以在
筛选起来很麻烦。也不能象细菌那样screen.
降低dna总量应该可行，但是1pg dna 就有太多的copy 了，而且据说，减低dna 总量只
能降低转化效率，不能很好的降低单个细胞转化copy数。
也想过混一些junk DNA在文库里，可是也不能保证单copy，而且不知道重复性高不高。 |
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m********r
发帖数: 124 | 29 我们是做生化的，体外纯化蛋白，做相互作用（fluorescence，ITC，pulldown），
顺便做点结晶和核磁，mapping作用位点。我第三年下了。
Rotation 的时候做一个真核信号通路蛋白的A domain（这也是老板postdoc做的
domain），是个很好纯化的蛋白，做的还行，有个coauthor的paper（师兄一作，4分左
右，话说我觉得实验室就这个水平了）。
加入实验室之前，另外一个rotation的学生做B和C蛋白，是原核的信号通路。当时
我感觉我加入实验室是不就做这个了。结果老板让我先做D和E， 顺便做原来的真核蛋
白的F domain，理由是应用的技术是一样的，要charaterize的蛋白性质也是相同的。
这是实情。这个时候有个小的grant, 关于蛋白BCDE的。结果我第二年冬天发现F
domain太大，不好做。而D和E表达起来比较困难，不可溶。加上B和C合作者有genetics
的data，所以就做了点这个。之后回国，春天回来做助教，上课考qualify，几乎春季
没做实验。完了之后，发现D和E 已经被马普的两个组发了。人家一... 阅读全帖 |
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m*****n
发帖数: 421 | 30 If you only want an approxmate prediction, you might try SWISS-MODEL, a
online homology modelling server. |
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s********r
发帖数: 312 | 31 补充下，这个kit好像价格不便宜，最好还是PCR筛过一遍后，用southern验证。或者直
接不做southern，设计引物扩增两个homology arm接头的地方然后测序。 |
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c******r
发帖数: 3778 | 32 绝对的啊
这东西一发现，可以搞的事情太多了。还有一堆homolog，还有整个pathway，从
transcription到function，可搞的东东太多了，都是cns的前途。。。
所以才是里程碑呢。 |
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a********6
发帖数: 14468 | 33 其实，小布什成功地进行了多年Knock down.
巴马这个Knock out, 不一定有knock down效果好，也就是有轰动效果而已。
，除了拉登homolog们要扬 |
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l******a
发帖数: 3339 | 34 老板跟我说hematopoietic stem cells很难进行homologous recombination，为什么？ |
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S*****P
发帖数: 323 | 35 http://news.sciencemag.org/scienceinsider/2011/06/sequence-yiel
DNA Sequence Yields Clues to Germany's 'Super Toxic' E. coli outbreak
by Martin Enserink on 2 June 2011, 5:50 PM |
Just from the high number of deaths and severe cases, scientists and public
health experts battling Germany's massive E. coli outbreak knew they were up
against something unusual. Now, early results from sequencing projects of
the enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) strain appear to confirm that
a never-before-see... 阅读全帖 |
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g*********d
发帖数: 233 | 36 目前表观遗传学(Epigenetics)通常被定义为基因表达通过有丝分裂或减数分裂发生了
可遗传的改变, 而DNA 序列不发生改变[1, 2]。表观遗传学的机
制主要包括DNA 甲基化、组蛋白修饰及非编码RNA。DNA 甲基化(DNA methylation)是指
在DNA甲基转移酶(DNA-methyltransferases, DNMTs)的催化下, CpG 二核苷酸中的胞嘧
啶被选择性地添加甲基, 形成5-甲基胞嘧啶[3, 4]。DNA 甲基转移酶有两种, 其中
DNMT1 主要起维持甲基化的作用, 能使半甲基化的DNA 双链分子上与甲基胞嘧啶相对应
的胞嘧啶甲基化, 可参与DNA 复制双链中新合成链的甲基化[5]; 而DNMT3a 和DNMT3b
主要起形成甲基化的作用, 能在未发生甲基化的DNA 双链上进
行甲基化[6]。DNA 甲基化一般与基因的沉默相关,DNA 去甲基化则与基因的活化相关[7
~9]。
组蛋白修饰(Histone modifications) 是指组蛋白的基础氨基末端尾部突出于核小体,
常在转录后发生变化, 包括甲基化、乙酰化、磷酸化和泛素化等翻译后的修饰... 阅读全帖 |
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g*********d
发帖数: 233 | 37 RNA干扰及其在动物繁殖中的应用
2009-12-28
RNA 干扰(RNA interference, RNAi)是生物进化过程中遗留下来的一种在转录后通
过 RNA 调控基因表达的机制, 它是指在真核细胞中引入双链 RNA分子从而导致具有序
列同源性的基因产生特异性基因沉默 (gene silencing)的现象 。由于 RNA干扰可以阻
断特定的基因表达, 具有超越疫苗和抗病毒药物的诸多优点, 因此在阐述基因功能以及
蛋白质相互作用等方面, 表现出诱人的前景。近年来随着分子生物学的发展, RNAi 的
机制也不断被阐明, 同时国内外研究也证实 RNAi 技术可以为动物繁殖过程中所涉及的
基因功能提供一条新的思路, 这在科研和生产实践上都具有重要的意义。
1 RNAi的发现
Matzke 等于 1989 年报道了启动子介导的序列同源性基因共转染烟草可引起转
基因表达发生沉默。 1990 年, Napoli 和 Van der Krol 等为了让矮牵牛花的颜色更
加鲜艳, 把与紫色相关的查尔酮(chalcone)基因转染到牵牛花内, 结果意外发现, 植物
体的颜色... 阅读全帖 |
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m******5
发帖数: 1383 | 38 homology recombination 有6k长臂和4k短臂
从knock in specific sequence p到长臂外面或者短臂外面都构成Long range了 |
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s******r
发帖数: 2876 | 39 为什么非得P到臂的外面？
如果你一开始已经鉴定完毕，
后面只要P个接头就行了吧，
实在不放心，第一批老鼠冷冻一些胚胎。
homology recombination 有6k长臂和4k短臂
从knock in specific sequence p到长臂外面或者短臂外面都构成Long range了 |
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e**r
发帖数: 1144 | 40 刚瞥见这么个报告标题,错过了
这个是怎么回事? 谁明白的讲讲? |
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c********b
发帖数: 363 | 42 在一种protist中平时genome是分裂成小片段的，在细胞分裂的时候出现small RNA协助
重新组装出完整的genome。 |
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f********n
发帖数: 6465 | 43 centuribob 是不是WHU和OHIO的前辈阿？
给我们讲一讲职业道路规划吧。 |
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M*****n
发帖数: 16729 | 45 ZFN不如homologous rec好。
有很多limitation.
你再读paper哦。 |
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A****A
发帖数: 16 | 46 利用ZFN等reagents做Knock in应该是一些lab目前的奋斗方向。ZFN可以产生sequence
specific DNA double strand break. DNA双链断裂可以有效的提高homologous
recombination的频率，从而达到Knock in的目的。目前，在fish里面实现高效的HR还
很困难，即使在有ZFN的帮助下。我不是做fish的，主要做DNA repair pathway. 我觉
得可以通过一些genetic或chemical的手段抑制fish的NHEJ pathway，来增加HR的频率。
model
transpare
rep
to
很多
serious的
大好 |
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M*****n
发帖数: 16729 | 47 下一步就是要拿到germline
光是chimera 还发不了大paper.
其实HR肯定可以发生，就是效率太低。
俺有一个想法就是
如果直接manipulate embryos效率太低的话，可以先转一个artificial chromosome作
一个stableline.然后跟抑制NHJR的mutant line cross，然后后代筛选homologous
recombinants.
鱼能产很多卵，筛选几万个应该不难。 |
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h**********r
发帖数: 671 | 48 以前就想到那个yeast homologous recombination了······ |
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f**********e
发帖数: 1994 | 49 先用 hmmer 看看 domain （600AA 大概有四个 domains), 再用
psipred 看看二级结构，顺便看看和已知结构有没有相似性，有的话
用 modeller 做 homology modeling, 和 structural
alignments. |
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j****x
发帖数: 1704 | 50 昆虫不是很熟悉，但是基因组/cDNA序列信息还是比较丰富的吧
“根本不知道序列是什么”，近缘物种总有些homolog吧，有这些信息做RACE足够了。
当然，RACE尤其是5'RACE，运气的成分比较大 |
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